[发明专利]一种基于肝细胞的药物肝毒性评估方法

说明书

技术领域

本发明属于细胞培养和生化指标监测领域，涉及一种药物肝毒性评估方法，尤其涉及一种基于肝细胞的药物肝毒性评估方法 

背景技术

肝脏是人体重要器官，负责代谢、解毒、凝血、免疫等多种生理功能。而在药物使用过程中，药物及/或其代谢产物可能导致肝脏损伤，称为药物性肝损伤(DILI)。DILI是过去50年药物因为安全性撤市最常见的原因，即使未撤市，药物的肝毒性也会限制很多药物的临床应用。由于多数药物导致严重DILI的机率很低(≤1/10000)，所以在临床实验阶段常常无法被识别出，成为困扰制药公司的难题。 

通常研究人员主要利用LDH渗漏、白蛋白分泌、尿素生成等指标对药物是否会导致细胞模型或动物模型的肝损伤进行筛选。然而，物种差异有可能对肝毒性判断产生影响，在人体中引起严重DILI的药物并未在动物试验中显示明确的肝毒性，一般也未显示剂量相关性毒性，很多导致严重肝毒性的药物在动物模型上却无毒性。同时有明显细胞毒性的候选药物在研发早期即会被排除，在临床或上市阶段导致严重DILI的药物往往并不会直接导致细胞毒性。临床实验时对能导致AST或ALT超出正常范围值三倍以上的药物会特别加以注意，因为他们可能导致严重的肝损伤，但如果直接测试药物对原代培养肝细胞的毒性，往往会忽略那些服药后导致肝脏中胆酸盐、胆红素浓度升高，从而造成肝脏损伤的药物。而且临床导致DILI的药物常常耐受性良好，但由于个体易感性不同，可能在极少数人群中才会产生肝损伤。由此可见，现存的药物肝毒性检测 方法并不能完全反映药物实际的肝损伤指数，本领域急需一种可准确评估药物的肝毒性的方法。 

发明内容

本发明的目的在于提出一种基于肝细胞的药物肝毒性评估方法，其利用双层胶原三维培养技术来模拟体内环境，诱导肝细胞形成肝板样结构和胆小管网络，在培养过程中维持肝细胞的生物学功能，以此为平台，对药物进行肝毒性筛选。 

为达此目的，本发明采用以下技术方案： 

一种基于肝细胞的药物肝毒性评估方法，其包括以下步骤： 

1)培养原代肝细胞； 

2)将所述原代肝细胞分成三组，分别为加入待测药物的组、加入待测药物和胆酸类化合物混合物的组、以及阴性对照组； 

3)分别检测培养基中的丙氨酸氨基转移酶(ALT)/天门冬氨酸氨基转移酶(AST)/乳酸脱氢酶(LDH)含量和尿素含量，并通过尿素含量计算尿素生成量； 

4)将三组培养基中的ALT/AST/LDH含量或尿素生成量进行比较，评估待测药物肝毒性。 

本发明所述的方法首先进行肝细胞模型构建，所用的肝模型可包括以各种培养方式构建的肝细胞模型，如悬浮培养、贴壁培养以及三维培养。然而三维培养方式可构建肝胆小管模型，能更有利地评估药物肝毒性。 

因此，在步骤1)中，所述培养为双层胶原三维培养，其诱导肝细胞形成肝板样结构和胆小管网络。所述双层胶原三维培养技术为在胶原上加入含有5％-10％胎牛血清的培养基，再加入不含血清、含matrigel和/或胶原的培养基， 形成夹心结构进行培养。优选地，加入含有5％-10％胎牛血清的培养基后培育2-6h。 

所述原代肝细胞为从人肝组织分离的细胞或动物肝细胞，所述动物包括大鼠、小鼠、狗、猪、猫、牛、羊、鸡、马、鹅、鸭和灵长类，所述灵长类包括猿、树鼩和猴；优选地，细胞的制备是经两步胶原灌流法消化制备得到。 

优选地，考虑到物种的差异性，选择人肝细胞作为原代干细胞进行肝细胞模型构建，可特别地形成具有胆管网络的人肝细胞三维培养模型。另外，考虑到人的个体差异，应采用≥3个的不同供体的人肝细胞来进行相同实验条件下的肝毒性评估，以此减少个体差异产生的误差。 

所述药物作用前细胞培养时间为1-4天，培养第1天至第4天，三维结构逐渐完善，以形成肝板样结构和胆小管网络。 

在步骤2)中，所培养的肝细胞贴壁后，即可加入待测药物、胆酸类化合物或对照品。所述胆酸类化合物为甘氨鹅脱氧胆酸GCDCA、鹅去氧胆酸CDCA、甘氨脱氧胆酸GDCA、脱氧胆酸DCA、甘氨胆酸GCA的游离酸或其无机盐；所述无机盐优选为钠盐；优选地，加入各物质后培养时间为1-3天。