[发明专利]Purα蛋白在抑制淀粉样前体蛋白编码基因表达中的应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明公开了Purα蛋白，以及编码此多肽的多核苷酸序列对淀粉样前体表达的调控作用。

背景技术

淀粉样前体蛋白(Amyloid Precursor Protien，简称APP)是一种广泛存在于体内的跨膜蛋白。它的异常代谢可以生成42个氨基酸组成的多肽(Amyloid βPeptide，简称Aβ)，这种多肽在神经系统内的聚集可以产生Senile plaque，而这种plaque由于可引起神经组织的兴奋性毒性的增强，激发炎症反应和炎性因子的浸润，并且可以阻断和破坏神经元之间的联系，被认为是Alzheimer’s病形成的主要原因。APP的代谢异常，如过表达，可以产生早发性Alzheimer病的症状，所以对APP基因表达和调控方面的研究，对于治疗Alzheimer病的发生和发展有着很重要意义。

发明内容

申请人通过长期研究发现，Purα蛋白和Egr-1蛋白(其序列表SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列、编码序列如序列表SEQ ID NO：4)是APP的编码基因表达过程中两个重要的调控因子。Purα蛋白对APP的表达有明显的负调控作用，而Egr-1蛋白则表现出强烈的正调控作用。两种因子共同作用，则Purα蛋白可以完全抑制Egr-1因子的正调控作用，也就是说Purα蛋白的结合位点与Egr-1蛋白的结合位点在APP的编码基因启动子区域是重合的。

基于上述研究成果，申请人完成了本发明。

首先，本发明公开了Purα蛋白在抑制淀粉样前体蛋白编码基因表达中的应用，在该作用中，Purα蛋白结合APP编码基因启动子的5‘UTR区域9063-9077：ggcggcgg tggcggc，并抑制Egr-1因子的正调控，Purα蛋白包括序列表SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

由于Purα蛋白有效抑制APP的表达，因此本发明还公开了Purα蛋白作为拮抗剂或抑制剂，在诊断或治疗与抑制淀粉样前体蛋白异常表达相关的疾病中的应用。

如申请人在背景技术部分所提到的，上述疾病，主要为阿尔茨海默氏病，目前本领域技术人员普遍认为该疾病与APP的过表达高度相关。

进一步的，本发明还公开了诊断或治疗与抑制淀粉样前体蛋白异常表达相关的疾病的药物组合物，包含上述的Purα蛋白与药学上可接受的载体。

本发明还公开了编码Purα蛋白的多核苷酸，具有序列表SEQ ID NO：2的核苷酸序列。

基于上述多核苷酸，本发明还公开了一种含有外源多核苷酸的重组载体，由多核苷酸与质粒、病毒或表达载体构建而成的重组载体。

本领域技术人员熟知上述重组载体的构建方法，是将编码Purα蛋白的多核苷酸序列可插入到载体中，以构成含有本发明所述多核苷酸的重组载体。其中所用的载体指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其它载体。在本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达的基于T7启动子的表达载体；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用于构建重组表达载体。

为了构建上述重组表达载体，可以使用生物学领域任何已知的方法，这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等，通过将编码Purα蛋白的DNA序列有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；噬菌体的PL启动子，和其它一些已知的可控制基因在原核细胞或真核细胞或其病毒中表达的启动子。

在上述基础上，本发明还公开了含有外源多核苷酸的遗传工程化宿主细胞，选自于下列一种宿主细胞：(a)用所述重组载体转化或转导的宿主细胞；或(b)用所述的多核苷酸转化或转导的宿主细胞。

利用上述的宿主细胞，选择合适的培养基进行培养，，即可分离纯化获得Purα蛋白。

上述的宿主细胞指原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；细菌细胞如鼠伤寒沙门氏菌；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞如果蝇S2或Sf9；动物细胞如CH0、COS或Bowes黑素瘤细胞等。