[发明专利]基于磁珠法提取土壤微生物DNA的试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种基于磁珠法提取土壤微生物DNA的试剂盒及方法。

背景技术

土壤除了为陆生植物提供营养源和水分之外，还是植物生长，进行光合作用、能量交换的主要场所；同时也具有微生物生长繁殖所需要的一切营养物质及各种条件，是微生物良好的生活场所，有“微生物的天然培养基”之称。

土壤是微生物的主要栖息地，是自然环境中最复杂的异质体系，这决定了土壤微环境的多样化和土壤微生物的高度多样性。每克土壤含有大约107个原核生物细胞，但仅有0.1％～10％的土壤微生物是可以培养的。在微生物学研究领域中，因为99％以上的微生物都是目前未(难)被纯培养的，过去人们对微生物世界的认识基本上都集中在不到1％的微生物上。对这些未培养微生物多样性及群落功能的研究将大大扩展我们对生命的了解，包括了解生命如何耐受极端环境、新的生物能源、生命进化以及微生物与环境之间的相互作用。

微生物环境基因组学为最大限度地挖掘微生物资源带来了前所未有的机遇，已经成为国际生命科学技术研究和开发最重要的热点和前沿。为了充分认识不可培养微生物的丰富资源，结合现代分子生物学技术的发展，已建立起了许多不需要对微生物进行独立培养的新方法和新技术。如变性梯度凝胶电泳(DGGE)法是将目标基因进行PCR扩增，通过对PCR产物进行分离和鉴定分析土壤微生物群落结构的组成信息；随机扩增多态性DNA技术(RAPD)是应用不同的随机引物在非严格的条件下进行PCR扩增，通过分析PCR产物在凝胶电泳上的条带多态性来反映样品中微生物的多样性。

关于土壤宏基因组学技术的构建已有许多研究报道，主要的突破在于需要足够高质量的DNA，因此直接从土壤环境中提取和纯化DNA是其中最关键的步骤。土壤宏基因组学技术在我国土壤及环境微生物生态学方面的研究才刚起步，对这一新技术的跟踪和应用，将会有力地促进我国土壤微生物生态学研究的发展。因此，研究一种高效提取土壤宏基因组DNA的试剂盒，对于大规模开展土壤宏基因组学研究显得十分必要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种能高效、快速的基于磁珠法提取土壤微生物DNA的试剂盒及方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：提供一种基于磁珠法提取土壤微生物DNA的方法，包括如下步骤：

土壤样品的前处理：取0.25-1g的土壤于2ml的离心管中，加入50-150μl Buffer A，300-900μl无菌水，300-900μl Buffer B，涡旋震荡30-60s，加入50-150μl Buffer C，200-400μl Buffer D，涡旋震荡30-60s，8000-10000g离心2-5min，去上清得沉淀A；

所述Buffer A为pH为4-6的0.5-2M的Tris-Cl缓冲液；

所述Buffer B为0.1-2M为包含0.1-2M的Al³⁺离子的溶液；

所述Buffer C为为包含2-6M的OH^-离子的溶液；

所述Buffer D为pH＝7-9的0.1-1M的Tris-Cl缓冲液；

土壤微生物DNA的提取：所述沉淀A加入300-400μl Buffer D，0.2-1g的0.5mm玻璃珠，300-400μl Buffer E，300-400μl Buffer F，涡旋震荡1-3min，4℃温度条件下11000-12000g离心1-3min，取500-1000ul上清液至1.5ml离心管，加入500-1000μl的酚、氯仿和异戊醇酚的混合液，所述混合液中酚、氯仿和异戊醇的体积份数比为25:24:1，涡旋震荡30-60s，4℃温度条件下13000-16000g离心1-3min，将上清液转移至1.5ml离心管，加入上清液等体积的Buffer G，震荡10-30s，放置5-10min，将1.5ml离心管放在磁力架上，进行磁珠分离，吸去液体，保留磁珠，往含有磁珠的1.5ml离心管中加入0.5-2mlBuffer H，打匀后室温静止5-10min，将1.5ml离心管放在磁力架上，进行磁珠分离，吸去液体，保留磁珠。往含有磁珠的1.5ml离心管中加入30-60μl Buffer I，即得土壤微生物DNA溶液；

所述Buffer E为5-15％的SDS溶液；

所述Buffer F由以下方法配制而成：取2-3g LiCl，1-2g Tris，3-5g EDTA，加入双蒸水溶解并调节pH为7.0-8.0，定容至100ml；