[发明专利]金线莲种子与真菌共生萌发快速成苗的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体来说是金线莲种子与真菌共生萌发快速成苗的方法。 

背景技术

 金线莲为地生兰，种子细微，比毛发还细小，不具胚乳，无发芽能力，只有在真菌共生下，才促进种子萌发生长,但其发芽率很低。而金线莲对生态环境要求也极为严苛，多生长在常绿阔叶林的沟边，小溪边的土质松散，阴凉潮湿地带，所以野生金线莲的成苗率就更低，或为万分之一。由于金线莲的自然繁殖率极低，生态环境的严重破坏，以及人为的盲目采挖，野生金线莲已经日趋枯竭，濒临灭绝。近年来，国内外研究人员纷纷加强对金线莲的药用价值开发力度，金线莲中许多具备药理活性成分的化合物不断地被发现与验证，金线莲的药用价值和保健功能为越来越多的人们所认知，市场需求越来越大。 

现有兰科植物的繁育模式—组培工厂(金线莲茎段为外植体无菌组培和金线莲种子无菌播种)繁育金线莲，虽然可以繁育大量的金线莲组培苗，但存在着许多不足：首先，育苗工艺繁琐，需要配制3或4种培养基质，原球茎需要转接3次或4次。其次，育苗的生产成本较高，需要无菌的工作环境；育苗周期较长，至少需要110-120天的培育时间，甚至更长的培育周期。 

金线莲组培苗从无菌的环境移栽到自然的生长环境，导致生长缓慢、植株抗病力低、有效药用成分达不到要求，对金线莲的药用价值开发形成制约。 

在自然界中，整个兰科植物的生活史都与共生真菌紧密联系着，共生真菌促进兰科植物种子萌发，为萌发的原球茎提供营养物质，促进其转化成幼苗成长。 

研究金线莲种子与共生真菌共生萌发快速成苗的方法，是完全模拟兰科植物在自然界中的自然生长规律，发现金线莲种子与共生真菌背后的共生规律，实现从金线莲种子与真菌共生萌发的有性繁育和快速成苗，这一种繁育模式具有成苗周期短，仅需70—90天；成苗抗病力和抗逆性强；金线莲成苗的有效药用成分接近野生金线莲。这一由金线莲种子和真菌共生萌发快速繁育金线莲幼苗的生产模式，可为其它珍稀兰科植物品种的保育开辟一个全新的高效繁育模式。 

目前，国内外能够把真菌的共生技术运用在兰科植物的有性繁育和人工规模化栽培品种是天麻，由上世纪80年代徐锦堂研发而成。此后，国内外的许多兰科真菌研究专家学者对其它兰科植物的共生真菌、真菌与兰科植物种子共生机理作了深入全面的理论研究和实践运用，但是还没有能够实现从兰科植物种子和真菌共生萌发、萌发的原球茎继续成长发育成幼苗规模化栽培这一关键阶段技术的突破。 

发明内容

本发明的目的是提供一种金线莲种子与真菌共生萌发快速成苗的方法，是全国首创的培育仿野生金线莲与真菌共生成苗的快速生长模式。 

实现本发明目的的技术方案是： 

金线莲种子与真菌共生萌发快速成苗的方法，包括如下步骤，

（1）金线莲共生萌发真菌的分离、纯化：

选取野生金线莲健壮幼苗根状茎的顶端突起部位、或是根状茎的节上突起部位；将这一部位用70%酒精表面消毒3-5s，置于清水琼脂培养基中培养、分离、纯化；

（2）制备金线莲共生萌发真菌的液体菌种：

将分离纯化后的金线莲有效共生萌发真菌—丝核菌（Rhizoctonia sp.），保藏号为CGMCC No.9728，从低温保藏的斜面试管活化后，制备成液体共生菌种备用；

液体菌种的配制比例为：20%马铃薯提取液∶1—5%山毛榉科树叶提取液∶0.5—1.5%白砂糖；

所述山毛榉科树叶提取液的制备采用现有技术，具体是将山毛榉科树叶与水按1：5的比例混合，煮沸半小时，滤出原液制成；

（3）制备金线莲共生萌发丝核菌的固体培养基：

培养基由山毛榉科树叶、山毛榉科木屑、麦麸或米糠按照比例混合，再经过高温杀菌，然后将丝核菌的液体菌种接种到培养基上，在温度为25℃—27℃的环境下培养，待共生真菌长满整个培养基，等待播种；

所述培养基原料配制的比例为：山毛榉科树叶30-45%∶山毛榉科木屑30-45%∶米糠或麦麸10-40%，培养基的含水量为60—62%；

（4）金线莲种子的播种与暗培养：

将成熟的金线莲种子撒播在长满共生真菌的培养基上，在温度为25—27℃的环境下，暗培养45—60天，金线莲种子与共生真菌共生萌发成长为粗壮的原球茎，原球茎长度达可达1.5-3cm；

（5）金线莲原球茎的转移与光培养：