[发明专利]用于检测鼠肺炎克雷伯氏菌的环介导等温扩增引物、试剂盒及方法

权利要求书

1.用于检测鼠肺炎克雷伯氏菌的环介导等温扩增引物，其特征在于：包括以下3对引物：F3和B3、FIP和BIP以及LF和LB；FIP的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，BIP的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示，F3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示，B3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示，LF的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示，LB的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示。

2.用于检测鼠肺炎克雷伯氏菌的环介导等温扩增试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括40μmol.L^-1的FIP1.0μL，40μmol.L^-1的BIP1.0μL，10μmol.L^-1的F30.5μL，10μmol.L^-1的B30.5μL，40μmol.L^-1的LF0.5μL以及40μmol.L^-1的LB0.5μL；F3和B3、FIP和BIP以及LF和LB为环介导等温扩增引物，FIP的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，BIP的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示，F3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示，B3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示，LF的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示，LB的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示。

3.如权利要求2所述用于检测鼠肺炎克雷伯氏菌的环介导等温扩增试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括2×反应缓冲液12.5μL，8U/μL Bst聚合酶1μL，25mM dNTP 1.5μL以及荧光染料1μL。

4.如权利要求3所述用于检测鼠肺炎克雷伯氏菌的环介导等温扩增试剂盒，其特征在于：所述荧光染料为质量分数0.5％的钙黄绿素水溶液。

5.用于检测鼠肺炎克雷伯氏菌的环介导等温扩增方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)提取待检测对象的DNA；

2)将以下组份进行混合，构建包括3对引物F3和B3、FIP和BIP以及LF和LB的25μL环介导等温扩增反应体系：

2×反应缓冲液12.5μL，40μmol.L^-1的FIP1.0μL，40μmol.L^-1的BIP1.0μL，10μmol.L^-1的F30.5μL，10μmol.L^-1的B30.5μL，40μmol.L^-1的LF0.5μL，40μmol.L^-1的LB0.5μL，8U/μL Bst聚合酶1μL，25mM dNTP 1.5μL，待检测对象的DNA2μL，荧光染料1μL，超纯水补足至25μL；FIP的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，BIP的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示，F3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示，B3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示，LF的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示，LB的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示；

3)将环介导等温扩增反应体系在63℃加热40min，然后在85℃加热5min，反应完成；

4)待反应完成后通过以下方式进行结果的判定：

反应完成后观察环介导等温扩增反应体系是否有颜色的变化，若环介导等温扩增反应体系颜色发生变化则为阳性反应，表明在待检测对象中检测到肺炎克雷伯氏菌；若环介导等温扩增反应体系颜色未发生变化则为阴性反应，表明在待检测对象中未检测到肺炎克雷伯氏菌。

6.如权利要求5所述用于检测鼠肺炎克雷伯氏菌的环介导等温扩增方法，其特征在于：所述待检测对象的DNA的提取方法为：

将待检测对象的血液、组织液或化脓液接种于肉汤培养基中，然后在37℃培养24h得菌液，取菌液离心，将离心得到的上清用DNA试剂盒提取DNA。

7.如权利要求5所述用于检测鼠肺炎克雷伯氏菌的环介导等温扩增方法，其特征在于：在检测时还分别设立阳性对照和阴性对照，以肺炎克雷伯氏菌基因组DNA为阳性对照，以超纯水为阴性对照；在进行结果的判定时，还与阳性对照和阴性对照比较，若待检测对象所对应的环介导等温扩增反应体系以及阳性对照所对应的环介导等温扩增反应体系均呈绿色，则判定待检测对象的检测结果为阳性反应，若待检测对象所对应的环介导等温扩增反应体系以及阴性对照所对应的环介导等温扩增反应体系均呈橘黄色，则判定待检测对象的检测结果为阴性反应。