[发明专利]一种髓过氧化物酶定量检测方法及检测试剂

说明书

技术领域

本发明属于医药生物技术应用领域，涉及一种髓过氧化物酶定量检测方法及检测试剂。

背景技术

髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)是一种来源于白细胞的亚铁血红素酶，主要存在于髓系细胞(主要是嗜中性粒细胞和单核细胞)的嗜苯胺蓝颗粒中，外界刺激可导致中性粒细胞聚集，释放MPO，血液中95％的MPO是由活化的嗜中性粒细胞脱颗粒释放入血的。MPO的相对分子质量约为150kDa，是由2个亚单位聚合而成的二聚体，每个亚单位又由一条重链(α链,相对分子质量约59kDa左右)和一条轻链(β链,相对分子质量约15kDa)构成，2个亚单位在α链处由1个二硫键相连。

目前MPO测定方法常用的为比色法活性检测和免疫学ELISA检测。比色法直接测定血液中MPO的酶活性，受血液中其他广泛存在的过氧化物酶，如嗜酸性粒细胞过氧化物酶等的干扰，导致假阳性结果。而已有的特异性的免疫检测ELISA法采用二株抗MPO抗体，一株作为捕捉抗体，另一株作为酶标抗体(显色抗体)，最常使用的是辣根过氧化物酶(HRP)系统，但检测的MPO具有过氧化物酶活性，可干扰辣根过氧化物酶活性，影响检测结果。因此本发明结合免疫反应的特异性及过氧化物酶活性的检测方法，可避免上述假性结果的产生。

发明内容

本发明的目的是提供基于髓过氧化物酶免疫反应及自身酶活性的髓过氧化物酶免疫吸附定量检测方法(MPO-ISA)。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种基于髓过氧化物酶免疫反应及自身酶活性的免疫吸附检测方法，在酶标板上包被髓过氧化物酶单克隆抗体，利用酶标板包被的髓过氧化物酶单克隆抗体与待测样品中的髓过氧化物酶特异性结合，通过吸附的髓过氧化物酶直接催化底物TMB，实现髓过氧化物酶的定量检测，MPO-ISA检测示意图见附图1。

其中，所述的髓过氧化物酶单克隆抗体为经过筛选的高特异性的单克隆抗体，能够与髓过氧化物酶结合，且不影响其底物结合中心、催化中心等与酶活性相关的位点。

所述的髓过氧化物酶单克隆抗体优选保藏号为CCTCC NO：C2014165的杂交瘤细胞株MCM1分泌的抗人髓过氧化物酶单克隆抗体mcm1。

一株抗人髓过氧化物酶单克隆抗体的杂交瘤细胞株MCM1，于2014年9月10日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2014165。

用于髓过氧化物酶定量检测的单克隆抗体mcm1，由所述的杂交瘤细胞株MCM1分泌。

所述的杂交瘤细胞株MCM1、所述的单克隆抗体mcm1在制备髓过氧化物酶检测试剂中的应用，优选在制备髓过氧化物酶定量检测试剂中的应用。

一种髓过氧化物酶定量检测试剂盒，含有包被所述的髓过氧化物酶单克隆抗体mcm1的固相材料。

其中，所述的固相材料选自酶标板、磁性微球、玻璃珠。

有益效果：

本发明利用髓过氧化物酶免疫反应和自身过氧化物酶的催化活性，仅使用一株单克隆抗体，就能实现髓过氧化物酶的定量检测，具有操作简便，缩短了检测时间，减少了经费支出的优点。相比现有ELISA法，还避免与辣根过氧化物酶交叉干扰检测结果。本方法具有良好的稳定性和重复性。

本发明利用人髓过氧化物酶(人白细胞提取)为免疫原，经过腹腔免疫及脾内免疫、常规细胞融合、筛选及克隆化，获得了一株能够稳定分泌抗髓过氧化物酶单克隆抗体的杂交瘤细胞株MCM1(CCTCC NO：C2014165)。经ELISA、免疫印迹等方法鉴定，该杂交瘤细胞所分泌的单克隆抗体mcm1能够特异性识别髓过氧化物酶，并且抗原抗体结合反应不影响抗原的酶活性。利用该特性，在酶标板上包被mcm1，与待测样品中的髓过氧化物酶特异性结合，通过吸附的髓过氧化物酶直接催化底物TMB，使髓过氧化物酶的定量检测具有更高的准确性。

附图说明

图1.MPO-ISA检测方法示意图。

图2.Western blot鉴定制备的抗人MPO单克隆抗体mcm1。所用抗原为MPO标准品500ng(8M80，来源于人白细胞，购自芬兰Hytest,Ltd.公司),mcm1浓度10μg/mL。18B7为抗人MPO单抗，购自芬兰Hytest,Ltd.公司，在本实验中作为阳性对照，浓度10μg/mL。Marker为蛋白分子量标准，购自Bio-Rad Laboratories,Inc.(#161-0374)。

图3.间接ELISA法比较MPO对HRP及AP显色系统的影响