[发明专利]一种细菌源抗菌肽的工业化分离纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白质多肽分离纯化领域，具体涉及一种细菌源抗菌肽的工业化分离纯化方法。

背景技术

抗菌肽是生物体内经诱导产生的一种具有生物活性的小分子多肽，分子量在2000～7000道尔顿，由20～60个氨基酸残基组成，具有强碱性、热稳定性和广谱抗菌性，对细菌、真菌、原虫、病毒等均有杀灭作用，尤其是对某些耐药性病原菌具有杀灭作用，是解决当前抗药性问题的一种全新类型的抗菌物质。目前，抗菌肽主要来源于昆虫、哺乳动物、两栖动物、植物、细菌等。

   抗菌肽产业是一个新兴的高科技生物工程和生物技术产业，其市场应用广泛。在农业上，可用于饲料添加剂，并且适合于多种动物的饲养；医药上，可以作为优秀的抗菌素替代品；工业上，可以作为绿色防腐剂；人类生活上，可作为保健品与抗菌物的替代品。

    当前，我国抗菌肽产业仍处于起步阶段。在国内抗菌肽的基础研究已取得一定的成果，如华南农业大学黄自然教授等从我国特有物种柞蚕蛹中经人工诱导和提取的产物（溶菌酶）--抗菌肽，是经过十几年的努力取得的一项首创性科研成果。抗菌肽分离纯化基础研究如华南农业大学陈海英博士论文中有论述，但在工业生产应用上有待进一步研究。国内抗菌肽产品主要用于动物用饲料及养殖，属于新一代动物保健产品，能有效解决现有抗生素使用过程中存在的诸多弊端，此种用法考虑成本因素一般不需要高纯度抗菌肽。

抗菌肽的生物学活性显示了其在医学上良好的应用前景。抗菌肽医药产品即以生物工程方法将抗菌肽纯化为一类新型药物，具有广谱性杀菌作用，并能抑制乙型肝炎病毒的复制，特别是对耐药性细菌，抗菌肽有较强杀灭作用，并能选择性杀伤肿瘤细胞，是一种具有作用靶点及新作用机制的化合物。目前，已有多种抗菌肽正在进行临床前的可行性研究，其中magainins已经完成或接近完成三期临床试验，即将上市。国内，抗菌肽在生物医药上的研究甚少，工业化分离纯化方法鲜有报道。

发明内容

本发明为了克服现有技术中缺乏工业化分离抗菌肽的技术缺陷，提供一种细菌源抗菌肽的工业化分离纯化方法。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

一种细菌源抗菌肽的工业化分离纯化方法，包括下列步骤：

    S1.将2500~6000L的细菌发酵液15000rpm/min离心，离心速度为750L/小时，去除菌体和发酵液残渣，收集上清液；

    S2.将上清液经10kda中空纤维柱超滤，去除大分子杂蛋白；

    S3.将S2超滤后的溶液经0.001um-0.0001um孔径反渗透膜超滤，去除液体中部分水分子、无机盐，得到抗菌肽浓缩液；

S4.以阳离子交换层析柱对抗菌肽浓缩液进行层析，分步收集洗脱液，得电泳纯抗菌肽。    

对于抗菌肽的分离纯化，现有技术中仅仅停留在实验室分离级别，实验室分离抗菌肽处理的菌体发酵液体积特别少，一般在几十毫升，最多也不会超过10L。所以，实验室分离抗菌肽的时候不会考虑材料昂贵、分离时柱子容易堵塞的问题。本发明通过大量的探索性试验，合理控制每一处理步骤的先后顺序和处理条件，得到一种适合工业化分离细菌源抗菌肽的方法。另外，本发明从技术上也适用于动物源抗菌肽的分离纯化，但抗菌肽在动物体内含量极微，从动物体内提取抗菌肽产量低、费时长、工艺复杂、费用昂贵，无法实现大规模生产，因此，在实际应用中，本发明并不适合分离纯化动物源抗菌肽。

    本发明首先利用高速离心去除菌体及发酵残渣，其目的是为了减少发酵液对中空纤维超滤的影响，提高中空纤维超滤的效率。而在超滤去除杂蛋白时，本发明选取截留分子量在10kda的中空纤维柱对发酵上清液去除大分子杂蛋白，检测抗菌肽效价表明，抗菌肽上清液经过超滤后，能够去除高分子量杂蛋白，且抗菌肽溶液的活性基本保持不变。选取多少截留分子量的中空纤维柱决定了杂蛋白去除的效果。虽然本领域技术人员都知道细菌源抗菌肽的分子量在1kda左右，只要选取截留分子量大于10kda的中空纤维柱就可以把抗菌肽留下来，但是，本领域技术人员并不知道杂蛋白的分子量有多大，到底选取截留分子量多大的中空纤维柱才可能尽可能多的将杂蛋白去除掉，发明人经过多年的研究发现，选取截留分子量在10kda的中空纤维柱可以尽可能多的将杂蛋白去除掉。