[发明专利]一种高特异性14个位点多个耳聋易感基因的多重PCR-LDR检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及DNA分子检测技术领域，具体是一种14个耳聋易感基因的多重PCR-LDR检测试剂盒。

背景技术

耳聋是一种严重影响人类生活质量的常见先天性疾病，它可以由单一基因突变或不同基因的复合突变引起，也可由环境因素(如医疗因素，环境暴露，创伤，药物等)或基因和环境两者共同作用而致。我国现有听力残疾人群2780万，居各类残疾之首(33％)。有研究发现GJB2、SLC26A4、线粒体基因是导致中国大部分非综合征性耳聋的3个最常见的致病基因。

GJB2基因是第一个被克隆和鉴定的遗传性耳聋致病基因，也是导致非综合性耳聋最常见的致病基因。在非综合征性耳聋中，约有20％是GJB2基因突变导致的。GJB2基因编码的Cx26蛋白在耳蜗内呈高水平表达，与相邻细胞的缝隙连接蛋白组成一个完整的缝隙连接通道。这些通道在信息传递和物质交换中起重要作用，是电解质、第二信使和代谢产物在细胞间转换的重要通道。GJB2基因突变后，使钾离子回流进入内淋巴的循环受到影响，导致感音神经性耳聋。GJB2基因最常见的突变类型是235de1C，其次是299-230delA＞T和176-191del16，其等位基因频率分别为11.90％、2.22％和0.65％。病理性235delC突变导致移码突变，产生无功能的蛋白质，使缝隙连接缺损，从而影响离子通道的正常开闭。299-300delAT突变导致Cx26多肽的CL区大部分缺失，TM3、EC2和TM4区完全缺失，可能丧失对缝隙连接通道pH值的调控，降低缝隙连接对异型蛋白的辨别能力。176-191del16指176位后16个碱基丢失，从59号密码子开始移码，使得终止密码提前至75号，产生无功能的蛋白质。

间隙连接蛋白家族中GJB3是编码间隙连接蛋白31(Cx31)，其功能主要以连接子复合体的形式融入膜间隙连接通道，参与细胞通讯。已有的耳聋群体分子流行病学资料表明，GJB3基因c.538C＞T点突变导致其编码的Cx31蛋白的结构与功能发生变化，可以通过影响细胞间隙连接的形成，从而导致遗传性耳聋的发生。

SLC26A4基因属于离子转运体26A家族(solute carder family26A。SLC26A)，编码离子转运相关蛋白。在机体离子成分平衡的维持中发挥重要作用。SLC26A4基因突变可导致常染色体隐性耳聋DFNB4和Pendred综合征(前庭水管扩大或伴内耳畸形、神经性聋和甲状腺肿)。SLC26A4基因最常见突变类型是IVS7-2A＞G，此外还包括2168A＞G，1226G＞A，1174A＞T，1975G＞C，2027T＞A等热点突变。

WSF1基因定位于人类染色体的4p16上，其编码产物是一种对糖苷内切酶敏感的膜糖蛋白，其功能与担任细胞内、外离子转运功能的微管网状组织密切相关，直接影响内耳的生理功能。研究证明，WSF1基因的突变被证实是导致低频感音神经性听力损失的主要原因之一。主要表现为两处突变：2158A＞G、2596G＞A，WFS1基因的突变杂合子可以引起常染色体显性遗传病低频感音神经性听力损失的突变杂合子可以引起常染色体显性遗传病低频感音神经性听力损失。

线粒体DNA突变是引起听力损伤的重要原因之一。其中，线粒体12SrRNA基因突变与综合征型耳聋和非综合征型耳聋相关，位于12SrRNA解码区的1555A＞G和1494C＞T突变是造成氨基糖甙类抗生素耳毒性和非综合征型耳聋常见的分子机制。这些突变可能造成12SrRNA二级结构的改变，破坏了线粒体蛋白的合成，降低细胞内ATP的产生，是细胞内外离子浓度失衡，耳蜗毛细胞凋亡，由此引起的线粒体功能障碍导致耳聋。

目前常用的基因突变检测技术主要包括：直接测序技术、限制性片段长度多态性(RFLP)、DNA芯片技术(Micro array)、变性高效液相色谱(DHPLC)、单链构象多态性(SSCP)和变性梯度凝胶电泳(DGGE)等。这些方法分别存在着成本高、准确率低、操作繁琐和重复性差等问题。