[发明专利]一种利用vWF稳定表达人凝血因子VIII的乳腺特异共表达载体

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用vWF稳定表达人凝血因子VIII的乳腺特异共表达载体。

背景技术

血友病是一种隐性遗传的出血性疾病，是由于血液中某些凝血因子的缺乏而导致的凝血功能障碍。根据所缺乏的特定凝血因子可以分为血友病A(hFVIII缺乏)、血友病B(hFIX缺乏)和血友病C(hFXI缺乏)。其中发病率最高的是由于基因hFVIII先天缺陷导致凝血因子VIII缺乏引起的血友病A，约占血友病总数的85％，男性发病率约为1/5000，其中三分之一的是由于基因自发突变引起的。

人凝血因子VIII基因(hFVIII)，主要在肝脏中合成，两个C区(各含约150个氨基酸组成)和一个大的B区(980个氨基酸)，各区的排列顺序为A1-A2-B-A3-C1-C2。该初级结构经糖基化、二硫键形成、酪氨酸残基硫酸化、蛋白质折叠等加工后分泌到循环系统中时，是由两条链以Ca²⁺连接组成，即A1-A2-B或A1-A2结构域所组成的重链及由A3-C1-C2构成的轻链，因B区断裂位点不同导致重链分子量在90～200kDa间，轻链分子量则为80kDa。科学家认为B区是非必须片段，目前不确定其主要功能。vWF(von Willebrand factor，血管性血友病因子)基因位于12号染色体上，其编码获得vWF蛋白是一种大分子量的多亚基糖蛋白，由多个220kD的亚基组成，因终产物的聚合度不一，分子量最高者可高达20MD。一方面，vWF可以介导血小板粘附于受损的血管壁，形成血栓得以止血；另外，正常情况下，vWF与hFVIII在血浆中紧密结合形成稳定的复合物。FVIII：vWF复合物的形成对维持hFVIII的半衰期至关重要，因为复合体的形成在体内阻碍了可能由细胞表面受体介导的hFVIII分解。活化时，重链删除残余的B区，A1和A2断裂并与脱离了vWF的轻链组合为活化的三聚体。

专利201310297925.2公开了一种利用家兔乳腺生物反应器制备第八凝血因子的方法。该方法制备的人第八凝血因子由于没有保护元件vWF极不稳定，是一种非常不稳定的蛋白质，极易失活，不利于活性因子的保存。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于克服目前以动物乳腺反应器制备人凝血因子VIII时，所得人凝血因子VIII不稳定的缺陷，提供了一种利用动物乳腺反应器制备人凝血因子VIII的方法。

一种利用vWF稳定表达人凝血因子VIII的乳腺特异共表达载体，包括骨架质粒和hFVIIIBDD-IRES-vWF片段，其中所述骨架质粒为pcDNA3.1(-)质粒，hFVIIIBDD-IRES-vWF片段的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。

所述共表达载体的启动子为P1A3启动子。

一种包含所述的利用vWF稳定表达人凝血因子VIII的乳腺特异共表达载体的重组表达转化体，所述重组表达转化体的宿主细胞是HC-11细胞株。

本发明所述重组表达转化体是指含有本发明所述转基因质粒的转化细胞。其中所述重组表达转化体的制备方法较佳地为：将上述转基因质粒转化至宿主细胞中制得。所述的宿主细胞较佳地为本领域常规的各种宿主细胞，只要能满足使所述转基因质粒稳定地自行复制，并且其所携带的外源基因可被有效表达即可，所述宿主细胞较佳地为真核细胞，优选地为HC-11细胞株。所述细胞株的制备方法为本领域常规制备方法，较佳地为市售可得。所述转化方法为本领域常规转化方法，其较佳地包括化学转化法、热激法或电转法。

一种利用动物乳腺反应器制备人凝血因子VIII的方法，该制备方法包括以下步骤：

(1)利用所述的利用vWF稳定表达人凝血因子VIII的乳腺特异共表达载体，通过显微注射法制备转基因哺乳动物；

(2)从步骤(1)所得转基因哺乳动物的乳汁中分离人凝血因子VIII即得。

步骤(1)所述转基因哺乳动物为转基因牛、转基因羊或者转基因小鼠。

本发明所述的转基因质粒为本领域常规的转基因质粒。所述转基因质粒较佳地为包含hFVIIIBDD-IRES-vWF片段的转基因质粒，所述转基因质粒的载体骨架较佳地包括：各种质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，本发明所述转基因质粒的载体骨架优选地为pcDNA3.1(-)质粒。