[发明专利]一种判别越冬蓝藻越冬复苏期界限的方法

权利要求书

1.一种判别越冬蓝藻越冬复苏期界限的方法，其特征在于包括如下步骤：

1）取发生蓝藻水华区域的水样，进行总RNA提取纯化，得到RNA样本a；

2）室内培养微囊藻，在对数生长期离心收集藻细胞，进行总RNA提取纯化，得到RNA样本b；

3）分别以RNA样本a和RNA样本b进行反转录得到cDNA-a和cDNA-b；

4）以步骤3）得到的cDNA-a作为荧光定量PCR的模板，以引物gvpC扩增微囊藻伪空胞基因，PCR完成后，导出相应的阈值循环数值，记为Ct_{野外目的基因}；以引物Micr特异性扩增微囊藻16srRNA内参基因，PCR完成后，导出相应的阈值循环数值，记为Ct_{野外同一样本16s}；两者差值Ct_{野外目的基因}-Ct_{野外同一样本16s}为校正后的细胞拷贝数，记作ΔCt_{野外目的基因} ；

5）以步骤3）得到的cDNA-b作为荧光定量PCR的模板，以引物gvpC扩增微囊藻伪空胞基因，PCR完成后，导出相应的阈值循环数值，记为Ct_{室内目的基因}；以引物Micr特异性扩增微囊藻16srRNA内参基因，PCR完成后，导出相应的阈值循环数值，记为Ct_{室内同一样本16s}；两者差值Ct_{室内目的基因}- Ct_{室内同一样本16s}为校正后的细胞拷贝数，记作ΔCt_{室内目的基因} ；

6）ΔCt_{野外目的基因}与ΔCt_{室内目的基因}差值为野外目的基因相对循环数，记作ΔΔCt，采用2^-ΔΔCt计算相对表达量；

7）取不同时间的水样重复上述步骤1）～6)，以时间为横坐标，步骤6）2^-ΔΔCt的值为纵坐标绘制曲线，根据曲线确定越冬蓝藻越冬复苏期界限。

2.根据权利要求1所述的判别越冬蓝藻越冬复苏期界限的方法，其特征在于：步骤2）中微囊藻为微囊藻Microcystis aeruginosa 7806。

3.根据权利要求1所述的判别越冬蓝藻越冬复苏期界限的方法，其特征在于：步骤2）中室内培养微囊藻的培养基为BG-11，培养温度为28～35 ℃，光照强度为20～60 μE·(m²·s)^-1，光照周期为9 h:15 h～12 h:12 h。

4.根据权利要求1所述的判别越冬蓝藻越冬复苏期界限的方法，其特征在于：引物gvpC序列为：gvpC-F  5^′-TGCTTTGCGTCAGTCTTTCC-3^′，

gvpC-R  5^′-TCCTTCACCTGTTTGGCTCT-3^′。

5.根据权利要求1所述的判别越冬蓝藻越冬复苏期界限的方法，其特征在于：引物Micr引物序列为：Micr184F 5^′-GCCGCRAGGTGAAAMCTAA-3^′，

Micr431R  5^′-AATCCAAARACCTTCCTCCC-3^′。

6.根据权利要求1所述的判别越冬蓝藻越冬复苏期界限的方法，其特征在于：荧光定量PCR的反应程序为：95℃ 3 min，紧接着40个循环，每个循环包括95℃ 15s、55℃ 30s和72℃ 45s。