[发明专利]一种采用酵母菌评价油田钻井液生物毒性的方法

权利要求书

1.一种采用酵母菌评价油田钻井液生物毒性的方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）将酵母菌进行活化并培养至稳定期，得到的酵母菌培养液进行离心；

（2）将上述离心后酵母菌体重悬后进行不连续密度梯度离心，收集最上层包含幼龄酵母菌或孢子的不连续密度梯度溶液，进行同步培养；不连续密度梯度离心的介质为海藻糖，在离心瓶中自下而上逐层铺加浓度递减的海藻糖水溶液，海藻糖水溶液的质量浓度为5%～70%，每层浓度逐级减少5%～30%；铺加3～5层海藻糖水溶液，每层体积相同或不同，以此制成海藻糖不连续密度梯度溶液；所述同步培养的培养温度为25～35℃，摇床转速为100～150rpm；

（3）采用上述同步培养后得到的酵母菌作为评价菌种，或将酵母菌制成冻干粉剂使用；

（4）使用标准毒性物质对酵母菌的生物毒性敏感性进行校正，同时确定油田钻井液对酵母菌的生物毒性分级指标；

（5）将酵母菌制备成酵母菌悬液，菌悬液中菌体浓度范围为10⁴～10⁸个/mL，并按浓度梯度制备油田钻井液测试样品；

（6）将酵母菌悬液与油田钻井液测试样品接触，通过染色法检测各浓度油田钻井液测试样品对酵母菌的致死率；酵母菌悬液与油田钻井液测试样品接触时间为5～10min；

（7）计算油田钻井液测试样品对酵母菌的半数有效浓度EC₅₀，根据生物毒性分级指标确定油田钻井液生物毒性等级；

所述的酵母菌为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）FE-B，保藏编号为CGMCC No.2735，或为热带假丝酵母（Candida tropicalis）突变株PF-UV-56，保藏编号为CGMCC No.0356。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：酵母菌的活化和培养过程具体为：首先制备酵母菌种子液，然后按照10%接种量（v/v）将酵母菌种子液接种于新鲜培养基进行扩大培养，培养温度25～35℃，摇床转速100～150rpm，培养至稳定期结束；将上述酵母菌培养液在500～1000g离心力下离心并收集菌体。

3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：铺加3层海藻糖水溶液，最上层的海藻糖水溶液体积是其它层的1.5～3倍。

4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：取步骤（1）收集的酵母菌体，然后用50mL去离子水重新悬浮，将重悬后的酵母菌液铺在制备好的海藻糖不连续密度梯度溶液顶层，在50～100g离心力下离心5～10min，收集最上层不连续密度梯度溶液，将其进行同步培养。

5.按照权利要求1或4所述的方法，其特征在于：在同步培养时，加入5～30g/L的糖蜜。

6.按照权利要求1或4所述的方法，其特征在于：将同步培养酵母菌液制成冻干粉剂，具体过程为：将酵母菌同步培养液在500～1000g离心力下离心并收集菌体，用20wt%～50wt%的冷冻干燥保护剂水溶液将收集到的菌体重新混悬，再分装于安剖管中进行冷冻干燥，先在4℃下维持6～8h、再在-20℃冰箱中维持6～8h、最后在-80℃维持24～48h；冷冻干燥时控制冻干机温度-50～-80℃、真空度1～10pa、冷冻干燥时间24～48h，直至样品表面出现裂痕，与冻干管内壁有脱落现象。

7.按照权利要求6所述的方法，其特征在于：冷冻干燥保护剂为甘油、乳糖、海藻糖、脱脂乳中的一种或几种。

8.按照权利要求7所述的方法，其特征在于：冷冻干燥保护剂为海藻糖。