[发明专利]高效低毒匹马霉素衍生物及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及微生物次级代谢产物分离技术，具体涉及一种高效低毒匹马霉素衍生物及其制备方法和应用。

技术背景

系统性真菌感染是一种严重的免疫系统缺陷并发症，其病原体往往具有高传播率、高增殖率、高致死率以及高耐药性等特点，严重威胁着人们的健康。由于真菌病原体耐药性的迅速发展以及药物间的相互作用等原因，目前可以在临床上用于治疗系统性真菌感染的抗真菌药物十分有限，并且治疗效果十分不理想。其中，多烯类抗生素对多种真菌病原体均具有高效的抗菌抑菌活性，且真菌病原体对其抗药性的发展十分缓慢，是目前公认的最有效的抗真菌药物。但多烯类抗生素同时也可以与哺乳动物细胞膜中的胆固醇作用，造成严重的溶血毒性，使其临床应用价值被严重限制。

匹马霉素是一种常用的多烯类抗生素，其结构简单、化学性质稳定，并被广泛用作食品(如奶酪等非灭菌食物)防腐添加剂、抗真菌兽药以及用于治疗角膜炎。匹马霉素是目前最常用的四种多烯类抗生素(匹马霉素、两性霉素B、制霉菌素及杀念菌素等)中，溶血毒性最低的一种，但其抗真菌活性同样也相对较低。相对偏低的药理性质，严重限制了匹马霉素在临床中的应用价值。因此，通过基因工程改造等方法，对匹马霉素的相关功能团进行改造优化，研究开发新的高抗真菌活性、低溶血毒性的匹马霉素衍生物，具有重要的临床应用及经济价值。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种高效低毒匹马霉素衍生物；目的之二是提供上述匹马霉素衍生物的制备方法；目的之三是提供上述匹马霉素衍生物的应用。

为了实现本发明的目的，本发明采用了以下技术方案：

一种高效低毒匹马霉素衍生物，分子式为C₃₃H₄₉NO₁₁，结构式如下：

上述高效低毒匹马霉素衍生物的制备方法，是以基因工程改造菌株Streptomyces chattanoogensis QZ01发酵菌体为原料，经菌体处理、有机试剂提取、反相色谱柱层析及高效液相色谱分离获得，具体步骤如下：

A、突变株QZ01的构建：构建P450单加氧酶基因pimG的失活质粒，并通过结合转移失活匹马霉素工业高产菌株Streptomyces chattanoogensis L10中的P450单加氧酶基因pimG，得到突变株QZ01；

B、突变株QZ01的发酵培养：将突变株QZ01的孢子接种于种子培养基中，以220rpm转速、在30℃下、摇床培养24h，得种子培养液；然后将种子培养液按10％接种量接种于发酵培养基中，以220rpm转速、在30℃下、摇床培养5d，得发酵培养液；

C、菌体处理：将突变株QZ01的发酵培养液离心处理，收集发酵菌体，用水洗涤菌体3次，去除洗涤液，将发酵菌体冻干；

D、有机试剂提取：将冻干的发酵菌体用甲醇超声提取3次，每次30min，离心获得提取液，提取液合并，减压浓缩得到粗样a；

E、反相色谱柱层析：将粗样a用重量比1.5-3倍量的甲醇溶解，静置，滤除沉淀物，然后上样于反相色谱柱层析，用体积比为0∶1～1∶0的甲醇水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液，经HPLC检测，目标化合物由1∶0配比的甲醇水溶液洗脱得到，浓缩目标化合物所在洗脱液，得粗样b；

F、高效液相色谱分离：将粗样b溶于少量甲醇中，经高效液相色谱分离纯化，得到匹马霉素衍生物。

上述制备方法，其中，步骤A所述的P450单加氧酶基因pimG的失活是通过将基因pimG的活性位点氨基酸Cys344突变为Ala实现的。

上述制备方法，其中，步骤B所述的种子培养基配方为葡萄糖1.75％，胰蛋白胨1.5％，氯化钠1.0％；发酵培养基配方为葡萄糖6.0％，酵母提取物0.7％，黄豆饼粉2.8％。

上述制备方法，其中，步骤E所述的用体积比为0∶1～1∶0的甲醇水溶液进行梯度洗脱，甲醇水溶液的体积比梯度依次为0∶1、3∶7、4∶6、6∶4、1∶0。

上述制备方法，其中，步骤F所述的高效液相色谱分离纯化是以甲醇与0.1％甲酸水溶液为流动相，甲醇与0.1％甲酸水溶液的体积比为54∶46，以流速为3ml/min，250mm×10mm的BDS HYPERSIL C18反相半制备柱为固定相，紫外检测器检测波长为303nm，每次进样50～100μl，收集对应色谱峰，多次累加后蒸干。

上述高效低毒匹马霉素衍生物可用于制备抗真菌药物及食品防腐剂。