[发明专利]一种鉴别饲料中羊乳成分和羊肉骨粉成分的核苷酸序列和方法

说明书

技术领域

本发明涉及检验检疫和生物技术领域，具体地说，涉及一种鉴别饲料中羊乳成分和羊肉骨粉成分的方法。

背景技术

羊痒病是与疯牛病密切相关的一类动物传染病。为防止羊痒病通过相关产品的贸易传入我国，我国颁布了贸易禁令对该病进行防控。1996年7月，我国农业部就发布了《关于严防痒病传入我国的通知(农检疫发〔1996〕7号)》，规定“禁止从上述有痒病的国家口(包括直接进口和转口)羊、羊胚胎、羊精液、羊内脏(含肠衣)及其制品、肉骨粉、骨粉、羊脂(油)以及含有羊蛋白的动物饲料等”。

饲料和饲料添加剂生产中可能添加的来源于牛羊的原料包括：肉粉、骨粉、血液及其制品、内脏及其制品、奶及其制品。在这些可能原料中，除奶及其制品是允许在进口饲料及添加剂中存在的之外，其它成分都是不允许添加的。

目前国内外对于同一种属不同组织成分来源的鉴别研究还比较少，主要有酶联免疫吸附法(ELISA)、氯仿分离后PCR检测法、水和次氯酸钠洗涤后PCR检测法，这些方法的使用范围很窄，且特异性不高，因此也很少在实际中应用。目前我国对进口动物饲料和饲料添加剂的把关主要采用普通PCR方法或实时荧光PCR方法对饲料中是否含有羊源性成分进行检测，但这类方法是对种属来源进行鉴别，无法对成分的组织来源进行鉴别和区分，即无法区分其中添加的是允许添加的乳源性成分，还是加入了贸易禁令范围内的组织成分。本技术建立的是一种可以对饲料中的羊源性成分进行组织来源鉴别的检测方法，对饲料中贸易禁令范围内和范围外的羊源性组织成分进行鉴别，满足进境饲料和饲料添加剂中羊痒病危险物质检测的需要，以实现科学、有效的执法把关，同时也可用来规范我国的饲料生产，保障畜产品安全和人民生命健康。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是提供一种用于鉴别羊肉骨粉成分的寡核苷酸。

本发明要解决的第二个技术问题是提供一种灵敏度高、特异性强、操作简便的用于鉴别羊肉骨粉成分的试剂盒。

本发明要解决的第三个技术问题是提供一种鉴别饲料中羊肉骨粉成分的方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了用于鉴别羊肉骨粉成分的组织标的物：羊骨粘连蛋白mRNA的一段117bp的核糖核酸序列(第309位-第425位)，其具有如序列表SEQ ID No.1所示的碱基序列。

5’-CCCCAUCGGCGAGUUUGAGAAGGUGUGCAGCAAUGACAACAAGACCUUCGACUCUUCCUGCCACUUCUUUGCCACCAAGUGCACACUGGAGGGCACCAAGAAGGGCCACAAGCUCCA-3’

其中，羊骨粘连蛋白对应的碱基序列如SEQ ID No.2所示。

根据上述选取的羊骨粘连蛋白的mRNA序列，本发明提供了一组用于鉴别羊肉骨粉成分的寡核苷酸，其具有SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的碱基序列，具体序列如下：

上游引物序列：5’-CCCCATCGGCGAGTTTGA-3’(SEQ ID No.3)

下游引物序列：5’-TGGAGCTTGTGGCCCTTC-3’(SEQ ID No.4)

本发明还提供了一种灵敏度高、特异性强、操作简便的鉴别羊肉骨粉成分的试剂盒，包括以下试剂：

1)RT-PCR反应液，其包括：

上游引物、下游引物、逆转录酶、Taq聚合酶和RT-PCR buffer；

其中，上游引物和下游引物分别是SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；

进一步地，本发明所用的逆转录酶通常为商品化试剂，例如RT Enzyme MixⅡ，购自Takara公司；本发明所用的Taq聚合酶通常为商品化试剂，例如HS(5U/μl)，购自Takara公司；本发明所用的RT-PCR buffer通常为商品化试剂，例如2×One StepRT-PCR BufferⅢ，购自Takara公司。

2)RNase Free dH₂O；

3)阴性对照，所述阴性对照为从羊乳中提取的总RNA；

4)阳性对照，所述阳性对照为从羊肉骨粉中提取的总RNA。

本发明还提供了一种鉴别羊肉骨粉成分的试剂盒的使用方法，该方法基于羊骨粘连蛋白的mRNA片段序列，并以其作为目标片段设计特异性引物、通过实时荧光RT-PCR鉴别饲料中羊肉骨粉成分，包括以下步骤：

1)取待测样品研磨，提取总RNA；