[发明专利]一种鉴别饲料中牛乳成分和牛肉骨粉成分的核苷酸序列和方法

说明书

技术领域

本发明涉及检验检疫和生物技术领域，具体地说，涉及一种鉴别饲料中牛乳成分和牛肉骨粉成分的方法。

背景技术

为防止疯牛病通过饲料及其它动物产品传入我国，我国根据OIE法典制定的BSE贸易禁令规定了禁止从疯牛病国家和地区直接或间接进口除牛皮、牛奶及奶制品、牛精液、牛胚胎、无蛋白油脂及其产品、骨制磷酸氢钙(不含蛋白或油脂)、完全由皮革或皮张加工的工业用明胶和胶原、照相用明胶、非反刍动物源性饲料及产品(出口国家或地区禁止使用的除外)以外的牛及牛产品。饲料和饲料添加剂生产中可能添加的来源于牛羊的原料包括：肉粉、骨粉、血液及其制品、内脏及其制品、奶及其制品。在这些可能原料中，除奶及其制品是允许在进口饲料及添加剂中存在的之外，其它成分都是不允许添加的。

目前国内外对于同一种属不同组织成分来源的鉴别研究还比较少，主要有酶联免疫吸附法(ELISA)、氯仿分离后PCR检测法、水和次氯酸钠洗涤后PCR检测法，这些方法的使用范围很窄，且特异性不高，因此也很少在实际中应用。目前我国对进口动物饲料和饲料添加剂的把关主要采用普通PCR方法或实时荧光PCR方法对饲料中是否含有牛源性成分进行检测，但这类方法是对种属来源进行鉴别，无法对成分的组织来源进行鉴别和区分，即无法区分其中添加的是允许添加的乳源性成分，还是加入了贸易禁令范围内的组织成分。本技术建立的是一种可以对饲料中的牛源性成分进行组织来源鉴别的检测方法，对饲料中贸易禁令范围内和范围外的牛源性组织成分进行鉴别，满足进境饲料和饲料添加剂中疯牛病危险物质检测的需要，以实现科学、有效的执法把关，同时也可用来规范我国的饲料生产，保障畜产品安全和人民生命健康。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是提供一种用于鉴别牛肉骨粉成分的寡核苷酸。

本发明要解决的第二个技术问题是提供一种灵敏度高、特异性强、操作简便的用于鉴别牛肉骨粉成分的试剂盒。

本发明要解决的第三个技术问题是提供一种鉴别饲料中牛肉骨粉成分的方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了用于鉴别牛肉骨粉成分的组织标的物：牛骨粘连蛋白mRNA的一段98bp的核糖核酸序列，其具有如序列表SEQ ID No.1所示的碱基序列。

5’-GAUGGUGCUGAGGAAACCGAAGAGGAGGUGGUGGCCGAGAACCCCUGCCAGAACCACCACUGCAAACACGGCAAGGUGUGCGAACUGGACGAGAACAA-3’

其中，牛骨粘连蛋白对应的碱基序列如SEQ ID No.2所示。

根据上述选取的牛骨粘连蛋白的mRNA序列，本发明提供了一组用于鉴别牛肉骨粉成分的寡核苷酸，其具有SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的碱基序列，具体序列如下：

上游引物序列：5’-GATGGTGCTGAGGAAACCGA-3’(SEQ ID No.3)

下游引物序列：5’-TTGTTCTCGTCCAGTTCGCA-3’(SEQ ID No.4)

本发明还提供了一种灵敏度高、特异性强、操作简便的鉴别牛肉骨粉成分的试剂盒，包括以下试剂：

1)RT-PCR反应液，其包括：

上游引物、下游引物、逆转录酶、Taq聚合酶和RT-PCR buffer；

其中，上游引物和下游引物分别是SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；

进一步地，本发明所用的逆转录酶通常为商品化试剂，例如RT Enzyme MixⅡ，购自Takara公司；本发明所用的Taq聚合酶通常为商品化试剂，例如TaKaRa ExHS(5U/μl)，购自Takara公司；本发明所用的RT-PCR buffer通常为商品化试剂，例如2×One StepRT-PCR BufferⅢ，购自Takara公司。

2)RNase Free dH₂O；

3)阴性对照，所述阴性对照为从牛乳中提取的总RNA；

4)阳性对照，所述阳性对照为从牛肉骨粉中提取的总RNA。

本发明还提供了一种鉴别牛肉骨粉成分的试剂盒的使用方法，该方法基于牛骨粘连蛋白的mRNA序列和特异性引物、通过实时荧光RT-PCR方法鉴别饲料中牛肉骨粉成分的方法，包括以下步骤：

1)取待测样品研磨，提取总RNA；