[发明专利]提高盐霉素发酵水平的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程技术，特别涉及一种提高盐霉素发酵水平的方法。

技术背景

放线菌是一类高GC含量的革兰氏阳性菌，目前已知抗生素中有60％以上是由放线菌合成。链霉菌是一类高等放线菌，具有强大的抗生素合成能力和复杂的形态分化，故一直受到人们的关注。聚酮类化合物是一类由放线菌产生的重要的次级代谢产物，其在抗肿瘤、抗寄生虫、抗生素领域都有极其重要的应用。前期的实验已经证明，聚酮类化合物的生物合成主要依赖I型、II型和III型聚酮生物合成基因簇，其主要使用的前体物是乙酰辅酶A、丙二酰辅酶A、甲基丙二酰辅酶A、乙基丙二酰辅酶A等等。

盐霉素属于聚醚类抗生素，是由白色链霉菌(Streptomyces albus)产生的。盐霉素具有广泛的抗球虫谱，50mg/kg就有显著的抑制作用。此外，盐霉素也能够抑制大多数革兰氏阳性菌的生长。盐霉素作用的机理同其它聚醚类抗生素相同，为钠钾离子的螯合载体，通过结合钠钾离子改变细胞离子梯度，导致细胞死亡。1979年日本就批准使用盐霉素作为抗球虫病药物，1987年欧共体批准使用盐霉素作为球虫抑制剂和生长促进剂，自1993年经我国农业部批准后，盐霉素作为鸡球虫抑制剂和饲料添加剂被广泛的应用于家禽业和畜牧业。目前，研究人员又发现盐霉素能够高效且特异性的杀死上皮肿瘤干细胞，其活性是目前临床上应用的紫杉醇的100倍，这引发了国际上对盐霉素的研究热潮。鉴于盐霉素的重要性，本申请人的微生物代谢国家重点实验室在2011年鉴定完成了盐霉素生物合成基因簇，2012年完成了其产生菌白色链霉素DSMZ41398(Streptomyces albus DSMZ41398)的全基因组测序。通过对基因组进行分析，在其染色体上我们找到了多个活跃的I型聚酮合酶生物合成基因簇，他们和盐霉素分享部分的前体，这暗示着这些基因簇的存在会分散前体物的供应，消弱盐霉素合成的前体供应，进而影响盐霉素的产量。

通过文献调研，发现前体物的充足供应会影响到聚酮链的延生，进而影响聚酮类化合物的最终产量。在阿维菌素产生菌中中断阿维菌素的生物合成可以大大提高寡霉素的产量，红霉素高产菌株全基因组测序后发现其中多个聚酮合酶生物合成基因簇均发生失活突变。然而对于白色链霉菌DSMZ41398来说，是否可以通过失活其中的活跃I型聚酮合酶生物合成基因簇来改变前体代谢流的流量和流向，使其更多的流向盐霉素的生物合成途径，进而提高抗生素的发酵水平并不清楚。

发明内容

本发明的目的，在于提供一种提高盐霉素发酵水平的方法。该方法通过中断一个I型生物合成基因簇，解除前体物供应的竞争、提高盐霉素前体的供应来实现盐霉素的高产。

为了实现本发明的目的，本发明采用了以下技术方案：

一种提高盐霉素发酵水平的方法，是通过在白色链霉素DSMZ41398(Streptomyces albus DSMZ41398)的染色体1,200,120bp-1,200,750bp位置引入基因突变，导致位于SLNWT0868-SLNWT0920(1,173,724bp-1,276,916bp)的I型PKS生物合成基因簇失活，使盐霉素在发酵中的产量得以提高；

所述白色链霉素DSMZ41398染色体上1,200,120bp-1,200,750bp的序列如SEQ ID NO.1所示。

所述I型PKS生物合成基因簇失活的构建步骤如下：

第一步：设计并构建用于1,200,120bp-1,200,750bp区域进行失活的同源重组质粒载体I；

第二步：将第一步构建得到的质粒载体I结合转移导入受体菌白色链霉素DSMZ41398中进行同源重组；

第三步：通过对突变株的筛选和验证硫链丝菌素抗性验证，并通过PCR产物片段大小的差异筛选得到SLNWT0868-SLNWT0920(1,173,724bp-1,276,916bp)的I型PKS生物合成基因簇失活的突变株。

所述的质粒载体I的构建方法是在质粒pJTU1278的SpeI/KpnI位点插入来自1,200,120bp-1,200,750bp区域左侧1410的PCR片段SpeI/HindIII和来自1,200,120bp-1,200,750bp区域右侧1352bp的PCR片段HindIII/KpnI。