[发明专利]一种用于蛋白质荧光标记的化合物的合成方法

说明书

技术领域：

本发明涉及生物大分子的荧光标记技术领域，具体涉及一种用于蛋白质荧光标记的化合物的合成方法。

背景技术：

生物大分子动态学的研究方法包括核磁共振、X射线晶体衍射、小角X光散射、荧光共振能量转移等。其中，荧光法由于其检测灵敏度高、实验方便等优点，是最为广泛的研究手段之一。

荧光能量共振转移是距离很近的两个荧光分子间产生的一种能量转移现象。当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱重叠，并且两个分子的距离在10nm范围以内时，就会发生一种非放射性的能量转移，即FRET现象，使得供体的荧光强度比它单独存在时要低的多(荧光猝灭)，而受体发射的荧光却大大增强(敏化荧光)。

在激发波长在500-600nm的荧光探针的商业化产包括GE公司的Cy3-NHS-ester、Cy3Maleimide等产品，然而这些产品水溶性较差，不利于对水溶液中的大分子进行标记，且连接的碳链较长，其较大的柔性不利于对生物大分子的结构和动态学特征进行精确地描述。而Alexei Toutchkine等人发展了Cy3.2-IA、neo-Cy3等一系列的化合物如下图所示，虽具有较好的水溶性，但是由于化合物的亲水和疏水基团分布不均匀，存在明显的亲水端和疏水端，使得探针在溶液中的分布不均匀，从而影响实验结果的准确性。

发明内容：

本发明的目的是提供一种用于蛋白质荧光标记的化合物的合成方法，它将花菁素类的化合物引入了多个亲水性的磺酸基团，提高了水溶性；进一步减少了连接位点与荧光基团的距离，提高了探针的刚性；从而解决了目前蛋白质荧光探针亲水端与疏水端分布不均匀、探针连接基团较长的问题。

为了解决背景技术所存在的问题，本发明是采用以下技术方案：其合成方法分为两步，第一步反应一是将1.2-1.5当量的化合物I和1当量的化合物II在1.5-3.5当量的醋酸酐中加热搅拌0.5-1小时，得到中间产物III；第二步反应二是将1当量的中间产物III与1.1-1.5当量的碘化钠在有机溶剂2中加热至40-70℃回流2-24小时，得到目标产物IV，即水溶性荧光化合物。

所述的化合物I结构中，对应的阳离子为钾离子或钠离子。

所述的化合物II结构中，对应的阳离子为钾离子或钠离子。

所述的有机溶剂1为甲醇与氯仿的混合溶剂或者甲醇与二氯甲烷的混合溶剂。

本发明的优点是：本发明的探针将花菁素类的化合物引入了多个亲水性的磺酸基团，提高了水溶性；进一步减少了连接位点与荧光基团的距离，提高了探针的刚性；从而解决了目前蛋白质荧光探针水溶性差、亲水基团与疏水基团分布不均匀、连接基团较长的问题。该荧光化合物作为一种蛋白质巯基标记的探针，可以有效降低背景荧光干扰，提高信噪比。同时，该荧光探针的柔性较小，有利于对生物大分子的结构和动态学特征的精确描述。本发明的荧光化合物的合成方法简便、毒性较小。

附图说明：

图1是本发明背景技术附图；

图2是本发明中探针的结构示意图；

图3是本发明两种反应的结构示意图；

图4是本发明激发发射图谱。

具体实施方式：

参看图1-图4，本具体实施方式采用以下技术方案：其合成方法分为两步，第一步反应一是将1.2-1.5当量的化合物I和1当量的化合物II在1.5-3.5当量的醋酸酐中加热搅拌0.5-1小时，得到中间产物III；第二步反应二是将1当量的中间产物III与1.1-1.5当量的碘化钠在有机溶剂2中加热至40-70℃回流2-24小时，得到目标产物IV，即水溶性荧光化合物。

所述的化合物I结构中，对应的阳离子为钾离子或钠离子。

所述的化合物II结构中，对应的阳离子为钾离子或钠离子。

所述的有机溶剂1为甲醇与氯仿的混合溶剂或者甲醇与二氯甲烷的混合溶剂。

本具体实施方式的优点是：本发明的探针将花菁素类的化合物引入了多个亲水性的磺酸基团，提高了水溶性；进一步减少了连接位点与荧光基团的距离，提高了探针的刚性；从而解决了目前蛋白质荧光探针水溶性差、亲水基团与疏水基团分布不均匀、连接基团较长的问题。该荧光化合物作为一种蛋白质巯基标记的探针，可以有效降低背景荧光干扰，提高信噪比。同时，该荧光探针的柔性较小，有利于对生物大分子的结构和动态学特征的精确描述。本发明的荧光化合物的合成方法简便、毒性较小。

本具体实施方式的实施例：

一、一种用于蛋白质荧光标记的化合物，该方法按下列步骤进行：