[发明专利]一种黑霉菌催化生产4-吡啶乙醇的方法

说明书

技术领域

本发明属于制药工程技术领域，特别涉及到黑霉菌细胞生物催化制备手性医药中间体(S)-1-（4-吡啶基）乙醇的技术。

背景技术

手性(S)-1-（4-吡啶基）乙醇是合成手性药物、精细化学品、农药品和其他特殊材料的重要中间体。生物催化不对称反应具有环境友好、条件温和、选择性高等优点,作为绿色高效制备羟基手性化合物的优先途径,被越来越多地应用于生产一些高附加值的手性化合物。生物催化制备手性(S)-1-（4-吡啶基）乙醇具有很好的应用前景。

生物催化具有催化效率高、选择性强、条件温和、环境友好等突出优点,是可持续发展过程中替代和拓展传统有机化学合成的重要方法。其中手性拆分和不对称合成是生物催化最具吸引力的应用领域。在作为生物催化剂的六大类酶中,水解酶能够催化动力学拆分外消旋体得到手性产品,在工业生物催化中一直扮演着重要角色。近几年来,氧化还原酶在工业上的应用得到了迅速增长。目前,采用水解酶动力学拆分法、生物催化法和生物氧化法工业制备光学活性手性化合物的比例为4:2:1。生物细胞还原法相对于动力学拆分法而言,最大的优势在于理论收率可达100%,原子经济性好。然而生物还原反应需要辅酶或辅因子的参与,一定程度上限制了其应用。由于辅酶依赖性的缘故,生物还原反应中多釆用整细胞作为催化剂,实现体内辅酶循环再生的同时免去了酶的分离纯化步骤。

 (S)-1-（4-吡啶基）乙醇是合成手性药物、精细化学品、农药品的重要手性砌块，由于有2个手性中心，使得化学合成较为困难，成本高。本发明将采用生物催化制备(S)-1-（4-吡啶基）乙醇。

发明内容

本发明采用黑霉菌细胞催化制备(S)-1-（4-吡啶基）乙醇，反应式如下：

底物4-乙酰基吡啶（1）经黑霉菌催化反应，得到产物(S)-1-（4-吡啶基）乙醇（2）。有多种微生物可以催化此反应，经过大量实验筛选，最终确定采用黑霉菌作为催化剂，因为其催化1反应的效果最好，反应收率、对映体过量率（ee%）均很高。

许多黑霉菌都可以进行生物催化本反应，然而，其效果不同，相差很大，经实验，本发明选用黑霉菌菌株为ATCC 96343，其催化本反应效果最佳。

培养介质：

1、　培养液成份：玉米浆( 以干物质计)含量为35-45g/L， 黄豆粉3-5g/L，酵母浸膏6-9g/L，葡萄糖18-22 g/L，麦芽浸膏25-30 g，硫酸铵0.5-0.7g/L，硫酸镁0.3-0.4g/L，磷酸二氧钾1.8-2.3g/L，碳酸钙 0.7 g/L,硫酸亚铁 0.18 g/L,硫酸锰 0.025 g/L;pH 5.3。

2、固体培养基成份： 在液体培养基中加入1.5-2%的琼脂粉。

黑霉菌湿细胞制备。黑霉菌经斜面、摇瓶、种子罐培养得到种子液；发酵罐加入培养液，装料系数为0.6-0.7，121℃高压灭菌30分钟，冷却至28-29℃，将黑霉菌ATCC 96343种子液接种至发酵罐，接种比例为10-15％，通气比为0.5-1V/（V分钟），即每分钟通气量为0.5-1倍发酵液体积，28-29℃培养36-40小时，用过滤式离心机离心得到湿黑霉菌细胞，用作生物催化反应催化剂。湿细胞制取技术为成熟技术。

由于底物、产物均对黑霉菌细胞有抑制作用，为了减少底物、产物对细胞的抑制，本发明采用棉纱布吸附底物，反应中，当底物被细胞催化反应，浓度降低时，底物从棉纱布溶出，补充反应消耗的底物。同时，产物被棉纱布吸附，减少了其在水中的浓度，从而大幅度降低了底物、产物对细胞的抑制。底物与棉纱布的比率，决定了反应液中底物、产物的浓度，而且，浓度还与反应温度、反应液成份有关。不同细胞对底物、产物的敏感度不同，所以，要进行大量实验，才能确定最佳的底物与棉纱布的比率。实验表明，对于本发明的菌株、反应液成份、反应温度，最佳的底物与棉纱布的比率为0.36-0.37。具体吸附时，将底物4-乙酰基吡啶用尺寸为0.5cmX0.5cm的棉纱布吸收，即得到吸附了底物的棉纱布。调节底物与棉纱布用量，使得底物与棉纱布的质量比率为0.36-0.37。所用棉纱布为普通棉纱布，从市场上购买后，切成0.5cmX0.5cm小块，灭菌，无菌保存待用。