[发明专利]鉴别鼓槌石斛和球花石斛的分子特异性标记引物及方法无效

专利信息
申请号: 201410593364.5 申请日: 2014-10-29
公开(公告)号: CN104313162A 公开(公告)日: 2015-01-28
发明(设计)人: 王慧中;冯尚国;史钰军;何仁锋;陈喆 申请(专利权)人: 杭州师范大学
主分类号: C12Q1/68 分类号: C12Q1/68;C12N15/11
代理公司: 杭州求是专利事务所有限公司 33200 代理人: 杜军
地址: 310036 浙江省*** 国省代码: 浙江;33
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摘要:
搜索关键词: 鉴别 鼓槌 石斛 分子 特异性 标记 引物 方法
【说明书】:

技术领域

发明涉及一种鉴别鼓槌石斛Dendrobium chrysotoxum和球花石斛D.thyrsiflorum的分子特异性标记引物,以及一种利用该特异性引物对鼓槌石斛和球花石斛标本快速鉴别的方法。

背景技术

鼓槌石斛Dendrobium chrysotoxum和球花石斛D.thyrsiflorum均隶属于兰科(Orchidaceae)石斛属Dendrobium下的顶叶组(Sect.Chrysotoxae Kraenzl.)。二者是中国传统名贵药材,具有滋阴养胃、润肺止咳、清热明目之功效,另外,还有增强人体免疫力,消除肿瘤,抑制癌症等作用。其中鼓槌石斛D.chrysotoxum被中华人民共和国药典(2010版)收录,并列为重点保护的野生珍贵药材品种。鼓槌石斛和球花石斛的茎、叶型、花型和花色都非常相似,从形态学上很难将二者相似种轻易鉴别开。因而在过去的很多年里,将鼓槌石斛D.chrysotoxum错误鉴定为球花石斛D.thyrsiflorum的情况时有发生。事实上,D.chrysotoxum与D.thyrsiflorum并非同种,这一结论已经得到了分子数据的支持。

对D.chrysotoxum和D.thyrsiflorum这两个相似种辨别的主要特征是宏观上差异并不是很显著的茎的形状。但是由于二者茎的形状易受生境、气候、生理状况等的影响而常常导致主观辨别上的偏差,而对长期保存的标本,特别是对古老标本、模式标本的重新鉴别,仅靠茎的形状差异更是难以准确鉴定。因此,在石斛分类研究上,分子标记技术成为了对石斛样本辅助鉴别的重要手段。

真核生物的核糖体基因rRNA的内转录间隔区(Internal Transcribed Spacer,ITS)的保守性非常强。种内ITS序列相对一致,而种间差异比较明显,这一特点使得ITS序列不仅适合于属内物种间的系统发育分析,而且非常适合于植物物种的分子鉴定。对D.chrysotoxum和D.thyrsiflorum的ITS区序列测序结果显示,D.chrysotoxum和D.thyrsiflorum的ITS(ITS1-5.8S-ITS2)序列长度均为641bp。因此,很难利用通用ITS引物(ITS4/ITS5)的PCR扩增、普通电泳对两个相似种进行准确鉴别。通过对两个相似种的ITS序列比对分析发现二者的局部序列存在碱基差异,本研究根据这一特点,设计开发了用于鉴定鼓槌石斛的ITS特异性引物。本发明为两个相似种的分子辅助鉴别提供了可能性,对有效的鉴别和保护两种石斛种质资源具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的一个目的是针对现有技术的不足,提供了一种可鉴别鼓槌石斛D.chrysotoxum和球花石斛D.thyrsiflorum的分子特异性标记引物。

本发明一种鉴别鼓槌石斛D.chrysotoxum和球花石斛D.thyrsiflorum的分子特异性标记引物,其核苷酸序列如下:

上游引物GCF:5’-CAAGCAGGGGCTAATGCTGCTGC-3’,如SEQ ID NO.1所示;

下游引物GCR:5’-ATGGATCGACGCATGGTTTGGGA-3’,如SEQ ID NO.2所示。

此对分子特异性引物是采用普通PCR技术,经过对鼓槌石斛D.chrysotoxum标本和球花石斛D.thyrsiflorum标本的核糖体ITS区序列的克隆测序,然后对测序获得的两个相似种ITS序列进行碱基差异比对,并以此设计分子特异性引物(GCF/GCR)。上述引物对具有极高的专一性,用此对引物对D.chrysotoxum和D.thyrsiflorum进行PCR扩增,可以从D.chrysotoxum中获得582bp大小的特异性片段。

本发明还涉及上述开发的分子特异性引物(GCF/GCR)在鉴别鼓槌石斛D.chrysotoxum标本和球花石斛D.thyrsiflorum标本中的应用。

本发明的另一个目的是提供利用上述分子特异性标记引物对鼓槌石斛和球花石斛进行快速鉴别的方法。

本发明采用上述分子特异性标记引物(GCF/GCR)作为特异性扩增引物,以待测石斛标本基因组DNA为模板,进行PCR扩增,对扩增产物进行电泳检测,若电泳结果出现582bp的DNA带谱,则待测石斛样本为鼓槌石斛D.chrysotoxum;若电泳结果未出现582bp的DNA带谱,则待测石斛样本为球花石斛D.thyrsiflorum。

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