[发明专利]一种水中噬菌体分离方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物分离技术，特别是涉及一种水中噬菌体分离方法。

背景技术

噬菌体是感染细菌、放线菌或支原体等原核微生物的细菌病毒的总称，它是病毒的一种。噬菌体的发现可追溯至100多年以前，1896年英国细菌学家Ernes Hankin首次报道了印度河水存在一种能通过瓷性滤器，热不稳定性的并具有强抗菌活性的物质，遗憾的是Hankin没能继续该方面的研究。直到1915年，英国微生物学家Frederick Twort首次在涂有金黄色葡萄球的培养基上发现了透明斑，并将该现象进一步阐述为病毒感染的假说。加拿大微生物学家Félix d’Herelle在1917年正式将该病毒命名为噬菌体。噬菌体结构简单，仅由外面的衣壳蛋白和内部的核酸组成，其核酸物质可分为dsDNA、ssDNA、dsRNA和ssRNA。噬菌体的一个主要性能就是能够专一的裂解其宿主菌，人们以此发现了噬菌体的广泛用途，主要包括用于治疗多重耐药菌感染的噬菌体治疗、灭活食品、水和植物中的致病菌的生物控制与噬菌体检测等。

噬菌体在自然界中分布广泛，几乎有细菌生存的地方就存在相应的噬菌体，其数量达到10³²，是细菌的10倍左右。由于噬菌体对宿主菌的专一裂解的特点，使得噬菌体的应用受到了限制，人们为此而发明了鸡尾酒疗法，这也就需要更多不同的噬菌体。但是，到目前为止，只有6000多株噬菌体被发现且进行了形态学的描述，这与自然界中存在的噬菌体实际数量存在着巨大差距。随着噬菌体的广泛应用，人们需要获得更多的噬菌体，但是，新的噬菌体发现速度却远远不能满足这种迫切需求。

传统的水中噬菌体分离方法所针对的水样体积一般只有1-1000mL，因此很难分离到水中浓度较低的噬菌体。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种使用方便的，能处理大水样的水中噬菌体分离方法。

本发明的技术方案概述如下：

一种水中噬菌体分离方法，包括如下步骤：

(1)正电荷硅胶颗粒的制备

①按比例，室温下称取6-7g氯化铝缓慢加入到950mL蒸馏水中使溶解；加入45mL、2M碳酸钠水溶液，出现乳白色的Al(OH)₃凝胶，调节pH值至7.0-7.5，加水定容至1000mL；在室温下静置18-24h；

②将步骤①获得的液体以1100g离心10-30min后弃上清；向沉淀中加入0.14M氯化钠水溶液至1000mL重悬沉淀，静置18-24h；

③重复步骤②2-4次，于121℃高压灭菌20min，冷却至常温；

④取1200-1400g粒径为150-300μm硅胶加入到步骤③获得的液体中，边加边搅拌，使之充分混匀，置于50-100℃烤箱中烤干，得到正电荷硅胶颗粒；

(2)洗脱液的配制

称取30g胰蛋白胨、15g牛肉粉、15g氯化钠、30-40g甘氨酸和20-30g氢氧化钠加蒸馏水至1L，加热溶解，调节pH为10.2-10.5，在121℃下高压灭菌20min；

(3)噬菌体的分离：

①在层析柱中加入适量灭菌蒸馏水，再加入正电荷硅胶颗粒不断搅拌去除气泡，通过蠕动泵以300-700mL/min速度将待测水样从层析柱的顶部流过层析柱；

②当待测水样全部流过层析柱后，用相当于正电荷硅胶颗粒质量3-4倍的洗脱液洗脱，收集洗脱流出液，调节pH为7.0-7.5；加入PEG6000使质量浓度为10％-15％并在搅拌下使PEG6000溶解，在常温下静置20-40min，12000-16000g离心20-40min，弃上清液，用0.1MpH＝7.0-7.5的PBS重悬沉淀并定容至10-100mL得液体1，向液体1中加入10×液体培养基，所述10×液体培养基的加入体积为液体1体积的1/10，得液体2；

③另取1mL10×液体培养基加灭菌生理盐水至10mL得1×液体培养基，将噬菌体的宿主菌接种至1×液体培养基中，30-37℃下培养18-24h；

④取1mL步骤(3)③获得的菌液接种至液体2中，30-37℃下培养18-24h，然后3000-4000g离心10-20min，收集上清液，取1mL上清液与100μL步骤(3)③获得的菌液混匀后静置5min，采用双层平板法检测上清液中是否有噬菌斑出现。

噬菌体的宿主菌为大肠埃希氏菌、沙门氏菌、大肠埃希氏菌O157︰H7、金黄色葡萄球菌、粪链球菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌或小肠结肠炎耶尔森菌。

本发明的优点：