[发明专利]一种纳米钻石靶向药物的制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及靶向纳米药物，具体涉及一种转铁蛋白修饰的纳米钻石靶向药物的制备方法，以及该方法制备的药物在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

目前用于癌症治疗的手段主要有手术、放疗、化疗和生物治疗等，但各种治疗手段都给患者带来极大的痛苦，而且对中晚期癌症病人作用不明显，因此研究有效且低伤害的靶向治疗方法尤为迫切。近年来随着纳米科学与生命科学、医学等学科的有机结合，纳米生物医学已经成为引人瞩目的新兴交叉学科之一。

由于纳米颗粒的尺寸效应，多适用于纳米载体，基于转铁蛋白-转铁蛋白受体高亲和力作用，可将转铁蛋白与药物载体偶联，通过与肿瘤细胞表面转铁蛋白受体相互作用特性来实现抗癌药物的主动靶向输送。基于这个策略，量子点、金纳米颗粒和纳米钻石等纳米颗粒与转铁蛋白偶联，然后与转铁蛋白受体过量表达的肿瘤细胞系相互作用证实其具有靶向输送特性。可见靶向载体制备的重要性，但靶向载体材料是否能真正实现靶向运输药物是人们急切关注的焦点，据我们了解，目前这样的报道很少见。由于纳米钻石具有特殊的生物相容性好、无毒性、尺寸小与化学性质稳定和表面易修饰等优点，在生物医学领域的应用潜力引起了人们广泛关注。因此，我们展开了针对转铁蛋白偶联纳米钻石且携带化疗药物制成的纳米药物系统是否能实现靶向输送药物目的的研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有主动靶向特性的转铁蛋白修饰的纳米钻石靶向药物的制备方法，以及该方法制备的纳米钻石靶向药物在抗肿瘤药物中的应用。

本发明提供的一种转铁蛋白修饰的纳米钻石靶向药物的制备方法，包括如下步骤：

(1)按每1mg转铁蛋白溶于每1mL硼酸缓冲溶液(PBS)中，接着按转铁蛋白(Tf)与阿霉素(DOX)质量比100︰6-10加入DOX，摇匀，室温下避光，在摇匀仪上反应过夜得到Tf-DOX复合物；

(2)称取干燥的羧基化的纳米钻石，按每毫克羧基化的纳米钻石加入1-1.5ml的MES(0.1M，pH6.00)缓冲溶液中，超声分散形成悬浊液，再按每毫克羧基化的纳米钻石中加入0.2mg EDC与0.3mg NHS，室温搅拌反应6h，以15000rpm离心5min，除去上清液，继而用pH 7.4 PBS缓冲液洗涤两次，弃去上清液，得到活化羧基的纳米钻石沉淀物；把活化羧基的纳米钻石沉淀物重新分散到PBS缓冲液溶液(pH7.4)中，超声分散形成悬浊液，加入制备的Tf-DOX复合物，室温下避光在摇匀仪上反应12h；然后于15000rpm离心5min，用PBS缓冲液清洗沉淀直至上清液无色为止，制得转铁蛋白修饰的纳米钻石靶向药物ND-(Tf-DOX)，冷藏；ND-(Tf-DOX)粒径大小约为235nm。

与现有技术相比本发明的有益效果：本发明选用的纳米钻石材料具有生物相容性好、无毒、化学性质稳定、表面易修饰等诸多优点。制备的ND-(Tf-DOX)纳米药物，经体外肿瘤细胞转运机制表明ND-(Tf-DOX)具有能量依赖，是由网格蛋白决定、转铁蛋白受体介导机制进入细胞；用人肝癌细胞(HepG2)和人正常胚胎肾细胞(HEK293)做对比，表明ND-(Tf-DOX)纳米药物进入细胞具有选择性；用人肝癌细胞(HepG2)和人宫颈癌细胞(HeLa)做对比，MTT法检测ND-(Tf-DOX)纳米药物对细胞活性的影响，表明该药物对癌细胞具有靶向抗肿瘤效应且具有选择性。以荷瘤小鼠为模型，将上述纳米药物通过尾部静脉注射至小鼠体内，检测其治疗肿瘤的效果(以阿霉素作为对照)，定期测量实验小鼠的体重和肿瘤体积，证实了纳米材料ND-(Tf-DOX)在生物体内的高生物兼容性，通过瘤体变化率对比说明ND-(Tf-DOX)药物注射组的瘤体增长较DOX组缓慢；实验后期处死动物，测得的各器官指数证实了ND-(Tf-DOX)药物对小鼠肝脏和脾脏的毒副作用明显低于传统化疗药物DOX。上述实验结果揭示了ND-(Tf-DOX)纳米药物可在制备抗肿瘤药物中应用。

附图说明

图1A低温及不同抑制剂条件下细胞对ND-(Tf-DOX)纳米药物吸收的影响

图1B不同游离转铁蛋白浓度条件，细胞内吞ND-(Tf-DOX)纳米药物差异

图1C HepG2和HEK293细胞摄取ND-(Tf-DOX)纳米药物的差异

图2 ND-(Tf-DOX)纳米药物对HepG2、HeLa细胞活性的影响

图3A不同药物组对肿瘤抑制的代表示意图(治疗期为31天)