[发明专利]检测牛白血病的荧光定量PCR的试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种检测牛白血病的荧光定量PCR的试剂盒，包括FRET-PCR引物、探针和标准阳性模板，其特征在于：所述FRET-PCR引物为上游引物和下游引物；所述探针为6-FAM探针和LCRed640探针；

所述上游引物具有SEQ ID No.1的核苷酸序列；

所述下游引物具有SEQ ID No.2的核苷酸序列；

所述6-FAM探针具有SEQ ID No.3的核苷酸序列；

所述LCRed640探针具有SEQ ID No.4的核苷酸序列；

所述标准阳性模板具有SEQ ID No.5的核苷酸序列。

2.一种检测牛白血病的荧光定量PCR的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括：FRET-PCR引物、6-FAM探针、LCRed640探针、PCR缓冲液、热启动Taq酶、dNTP、标准阳性模板、对照品；所述对照品为超纯水。

3.根据权利要求2所述的检测牛白血病的荧光定量PCR的试剂盒，其特征在于:所述标准阳性模板是由所述的FRET-PCR的引物和探针对牛白血病前病毒DNA进行扩增获得的扩增核苷酸片段插入pUC57载体构建而成的重组质粒。

4.根据权利要求2所述的检测牛白血病的荧光定量PCR的试剂盒，其特征在于:所述FRET-PCR引物的终始浓度为0.2μM；所述6-FAM探针的终始浓度为0.2μM；所述LCRed640探针的终始浓度为0.2μM。

5.根据权利要求4所述的检测牛白血病的荧光定量PCR的试剂盒，其特征在于:所述热启动Taq酶的终始浓度为2.0U/20μL；所述dNTP的终始浓度为5μM；所述标准阳性模板的终始浓度为5ng；所述对照品的终始浓度为5ng。

6.一种牛白血病的荧光定量PCR的扩增检测体系，其特征在于：所述扩增检测体系包括20μl的PCR扩增检测体系：DNA模板或者定量标准试剂10μl、1xPCR缓冲液、1μM上游引物、1μM下游引物、0.2μM的6-FAM探针、0.2μM的LCRed640探针、2个单位的Taq酶和200μM dNTP。

7.利用权利要求2-5所述的试剂盒进行牛白血病的荧光定量PCR的检测方法，其特征在于：在孔板中加入试剂，加样完毕后，将孔板放入系统中，设置反应条件为：预变性、18个温度递减的高严谨循环、30个欠严谨的荧光获得循环、1个持续荧光获得的熔解循环和1个降温循环；

预变性：1*2min@95℃；18个温度递减的高严谨循环：6*1sec@95℃,12sec@70℃，8sec@72℃；9*1sec@95℃，12sec@68℃，8sec@72℃；3*1sec@95℃，12sec@66℃,8sec@72℃；

30个欠严谨的荧光获得循环：30*1sec@95℃,30sec@56℃(在此收集荧光),30sec@67℃,and 30sec@72℃；1个熔解循环：1*1sec@95℃,10sec@38℃，@85℃持续收集荧光；1个降温循环：1*1sec@38℃。

8.根据权利要求7所述的试剂盒进行牛白血病的荧光定量PCR的检测方法，其特征在于：所述孔板为96孔板，所述系统为罗氏480Ⅱ系统；加入检测牛白血病的荧光定量PCR的试剂盒10μl，所述试剂盒包括1xPCR缓冲液、1μM FRET-上游引物、1μM FRET-下游引物、0.2μM的6-FAM探针、0.2μM的LCRed640探针、2个单位的Taq酶、200μM dNTP、超纯水，10μl样品DNA模板或者定量试剂。

9.权利要求2-5任一项所述的检测牛白血病的荧光定量PCR的试剂盒在检测牛白血病的应用。