[发明专利]基孔肯雅病毒核酸分子特征标准样品及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基孔肯雅病毒核酸分子特征标准样品及其制备方法，属于分子生物学领域。

背景技术

基孔肯雅病毒(chikungunya virus, CHIKV)，经伊蚊传播，以发热、皮疹及关节疼痛为主要特征的急性传染病。1952年首次在坦桑尼亚证实了基孔肯雅热流行，1956年分离到病毒。本病主要流行于非洲和东南亚地区，近年在印度洋地区造成了大规模流行。

目前，基孔肯雅病毒的诊断方法主要由病毒分离、琼脂糖免疫扩散技术、分子生物学等诊断技术。近年来，随着分子生物学技术的发展，实时荧光PCR技术以其快速、敏感、特异性好的优点占很大优势，引起了众多研究者的关注，但现有分子生物学检测试剂盒多为公司根据文献设计阳性对照，没有统一的标准。随着进出口贸易的增大，检验流程时限缩短，难以保证实验室的质量控制。

发明内容

针对上述问题，本发明研制一种基孔肯雅病毒核酸分子特征标准样品，可用于特征序列检测时的阳性对照，以保证检测结果的可溯源性。具体技术方案如下。

本发明所述基孔肯雅病毒核酸分子特征标准样品的制备方法，主要包括如下步骤：

1）          合成病毒序列，其序列如Sequence NO.1所述：并在每段序列前增加一个T7启动子；

2）          将合成序列平端克隆入质粒并通过酶切鉴定及胶纯化；

3）          目的片段和载体的连接反应；

4）          通过感受态细菌转化质粒；

5）          重组质粒提取；

6）          采用分光光度计法对重组质粒进行质量检测；

7）          选取纯度和完整性均合格的重组质粒，将溶液混合在一起，并再次测定浓度和纯度，然后进行分装冻干，将制备好的标准样品置于-80℃冰箱保存。

上述基孔肯雅病毒核酸分子特征标准样品的制备方法所述步骤中还包括重组质粒的鉴定：即从步骤4）得到的菌液中取1-3个菌落，接种于含氨苄的LB培养基中培养，提取质粒，然后进行PCR扩增，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，筛选阳性克隆。

上述基孔肯雅病毒核酸分子特征标准样品的制备方法所述步骤中还包括核酸序列测定及序列对比分析：即将经PCR鉴定为阳性重组质粒的细菌测序并进行同源性分析。

本发明所获得的基孔肯雅病毒核酸分子特征标准样品，即为含有Sequence NO.1的核苷酸序列的重组载体。而且所述重组载体为质粒。

进一步地，上述步骤2）所述克隆和胶纯化的具体步骤为：将序列平端克隆入pUC19质粒中；酶切鉴定选择EcoR I和XbaI作为质粒载体的克隆位点进行酶切，37℃，反应1-2h，反应体系为DNA 16μL，10X buffer 2μL，EcoRI 1μL，XbaI 1μL；酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳，切取所需片段，胶回收纯化。

进一步地，上述步骤3）所述目的片段和载体的连接反应具体步骤为：条件为16℃，反应16h，反应体系为：步骤2）得到的纯化产物1 μL，合成序列X μL：其与载体的摩尔比为3~20：1，T4 Ligase 1μL，10X Ligase solution 1μL，加去离子水补齐至10μL。

进一步地，上述步骤4）所述感受态细菌转化质粒的具体步骤为：将感受态细菌加到预冷无菌的Eppendorf管内，取步骤3）得到的连接反应液，加到含DH5α感受态细菌的管中，轻混匀，冰上静置30min，42℃热激90s，不要摇晃管，冰上静置5min，加不含氨苄的LB培养基，37℃，225rpm，培养1h得转化液；取转化液涂布于含氨苄的LB固体培养基上，37℃倒置培养16h。

本发明是基于病毒的RNA序列与cDNA序列互补的原理基础之上，利用DNA合成技术合成病毒的特征核酸序列，将其克隆入质粒载体中，制备出一种包含病毒特征序列信息、适于分析样品中该病毒及含量水平的标准样品；本发明提供的标准样品均匀性好、稳定性强、可长期保存、纯度好，并且制备方法过程简单，可以为基孔肯雅病毒检测研究、医用研究等提供标准样品，以实现不同实验室结果比对，从而保证实验室的质量控制；同时也为检验检疫机构、进出口贸易等企业实现对基孔肯雅病毒的快速准确检测提供了标准样品。

附图说明

图1质粒酶切电泳图，图2重组质粒测序图，图3序列比对报告。

具体实施方式