[发明专利]一种基于PCR-RFLP鉴定金银花品系鸡爪花和大毛花的方法

说明书

技术领域

本发明属于植物品种鉴定领域，涉及一种基于PCR-RFLP鉴定金银花品系鸡爪花和大毛花的方法，特别涉及一种基于PCR-RFLP鉴定金银花品系鸡爪花和大毛花的试剂盒及其鉴定方法。

背景技术

药材金银花的基源植物为忍冬属植物忍冬Lonicera japonica Thunb.,在长期的栽培过程中其形态发生了明显的变异和分化，形成了很多农家栽培品种或品系。对山东、河南传统金银花道地产区进行调查，发现金银花栽培品系“大毛花”和“鸡爪花”是金银花的主流商品，其原植物形态、药材性状、化学成分均存在一定差异。“大毛花”因其叶片和花蕾被毛多而密得名，鸡爪花的花蕾细长聚拢，形似鸡爪，因而命名为“鸡爪花”，其植株腺毛多不发达。由于鸡爪花和大毛花的适生长环境不同，民间栽培引种需要先确定其品系。目前人们主要通过传统的性状鉴别方法来区分这两个主流品系，但在幼苗时期，两个品系金银花的性状差别不明显，且不同产地的金银花性状亦有区别。此外，也有研究表明可采用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术和同工酶(POD)电泳分析技术对这两个品系进行鉴别，但鉴别结果不够直观，操作略显复杂。

鸡爪花和大毛花商品价值也有区别，传统认为，大毛花品系更符合传统道地产区的特征，价格较高。然而，大毛花和鸡爪花苗期形态相似，而市场流通的商品金银花经由炮制加工、运输储藏后，形态有所改变，腺毛脱落，难以区分。因此，急需建立科学性强、使用方便的种质鉴别方法。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种用于鉴定金银花品系鸡爪花和大毛花的试剂盒。

本发明所提供的用于鉴定金银花品系鸡爪花和大毛花的试剂盒，具体含有由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对，以及限制性内切酶AvaII或其同裂酶。

其中，序列1由21个核苷酸组成，序列2由21个核苷酸组成。

所述的试剂盒在鉴定或辅助鉴定待测金银花为鸡爪花品系还是大毛花品系中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供一种基于限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)技术鉴定或辅助鉴定待测金银花为鸡爪花品系还是大毛花品系的方法。

本发明所提供的基于PCR-RFLP技术鉴定或辅助鉴定待测金银花为鸡爪花品系还是大毛花品系的方法，具体可包括如下步骤：

(1)以待测金银花的基因组DNA为模板，采用由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成的引物对进行PCR扩增；

(2)采用限制性内切酶Ava II或其同裂酶对步骤(1)所得PCR产物进行完全酶切；

所述完全酶切是指酶切体系中所有可以被限制性内切酶Ava II或其同裂酶识别并酶切的所述PCR产物均被切开，即不存在酶切不完全的情况。

(3)按照如下方法确定所述待测金银花的品系：若经步骤(2)酶切获得的DNA片段为如下(a1)，则所述待测金银花为或候选为鸡爪花品系；若经步骤(2)酶切获得的DNA片段为如下(a2)或(a3)，则所述待测金银花为或候选为大毛花品系。

(a1)大小分别为66bp和181bp的两个DNA片段(鸡爪花纯合子)；

(a2)大小为247bp单一DNA片段(大毛花纯合子)；

(a3)大小为66bp、181bp和247bp的三个DNA片段(大毛花杂合子)。

进一步，所述步骤(3)中，大小为66bp的DNA片段的核苷酸序列为序列表中序列3的第1-66位，大小为181bp的DNA片段的核苷酸序列为序列表中序列3的第67-247位，大小为247bp的DNA片段的核苷酸序列为序列表中序列4。

在实际应用中，判断酶切产物中是否含有目的DNA片段时，可通过将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，看电泳图谱上是否含有目的条带：电泳图谱上含有目的条带，则酶切产物中含有相应的目的DNA片段。

在实际应用中，判断酶切产物中是否含有序列3的第1-66位、序列3的第67-247位或序列4所示DNA片段，可通过对酶切产物进行核苷酸序列测定来判断。

在所述方法的步骤(1)中，进行所述PCR扩增时，组成所述引物对的两条引物在反应体系中终浓度均为80nmol/L。