[发明专利]外周血exosome来源的肝癌诊断和预后标志物及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物医学领域，涉及人类外周血exosome来源的肝癌诊断和预后标志物及其应用；具体涉及人类血液exosome来源的Rab27A/B蛋白作为肝癌诊断和预后标志物及其在制备诊断肝癌和判断肝癌预后试剂盒中的应用。

背景技术

原发性肝癌(HCC)是世界范围内前十名常见肿瘤，有非常高的死亡率，每年大约有一百万人死于这种疾病。找到与原发性肝癌进展有关的肿瘤标志物，进而指导临床对肝癌患者来说将有非常重要的意义。

exosome是多种细胞分泌的一种30-100nm大小的膜性囊状结构。肿瘤细胞较正常细胞能分泌更多的exosome，分泌到细胞外的exosome携带有大量肿瘤特异的抗原蛋白、抗原伴侣分子和核酸，通过exosome中的蛋白质和核酸促进肿瘤细胞之间信息交流，产生旁路效应，促进肿瘤生长和转移。Rabinowits等发现肺癌病人外周血中exosome平均蛋白浓度达到2.85mg/ml(95％CI 1.94-3.76)，而非肿瘤病人只有0.77mg/ml(95％CI 0.68-0.86)，远远低于肺癌病人(P<0.001)；从exosome蛋白浓度95％的区间来看，肺癌病人和非肺癌病人的区间无重叠。因此，外周血中exosome蛋白浓度有可能作为肺癌诊断的标志物。申请人所在课题组前期研究也发现从卵巢癌腹水中分离得到的exosome含有大量肿瘤-睾丸抗原和免疫分子，国内外学者利用exosome中的肿瘤抗原蛋白制作exosome亚细胞瘤苗，在体外和动物实验以及部分人体实验都取得了好的效果。肿瘤分泌的exosome较肿瘤细胞更易进入外周血，即使在脑胶母细胞肿瘤，纳米级的exosome也能透过致密的血脑屏障进入外周血，并通过外周血exosome中EGFRvIII基因突变的检测来明确胶母细胞肿瘤的诊断和治疗；此外，肿瘤细胞分泌exosome的能力较正常细胞更强，exosome中的核酸和蛋白质受到双层脂质膜的保护不易被血中的蛋白酶和核酸酶降解；所有上述因素都是利用外周血exosome作为肿瘤早期诊断 的最佳理由。在前列腺癌、乳腺癌和卵巢癌，国外学者利用外周血exosome中存在较高的肿瘤相关抗原蛋白来进行早期诊断。

Rab家族属Ras超家族的小GTP酶，目前有近70个家族成员，是参与囊泡融合及运输相关的一类膜相关蛋白，参与细胞的分泌、胞吞、信号转导等，是细胞内外信息交流的重要调控蛋白。Rab27A和Rab27B组成了Rab27亚家族，并具有71％同源性。上述两种蛋白在exosome运输(Trafficking)、与细胞膜对接(docking)、融合(fuse)和胞吐(exocytosis)上所起作用最突出。Rab27A蛋白在肺癌、乳腺癌、脑胶质母细胞瘤的高表达与这些肿瘤侵袭和转移等恶性生物学行为密切相关。但，有关Rab27B的研究较少，Hendrix等的研究表明：人体胚胎各个器官细胞均无Rab27B表达，而成熟的器官各个细胞均有表达。申请人所在课题组前期对正常肝组织、肝炎组织、肝硬化组织的、正常胃和大肠组织Rab27B蛋白表达进行了检测，发现上述组织均存在Rab27B蛋白表达，然而，其对应的肿瘤组织却不同程度的丢失。因此，Rab27B蛋白可能是一种与细胞分化相关的蛋白，由于肿瘤细胞的去分化而发生丢失。

目前，肝癌的诊断主要依赖于影像学上发现肝内肿物，包括超声、CT、核磁共振(MRI)等，同时结合血清中的肿瘤标志物如AFP等。但是，这两种方法的敏感性及特异性都不是十分令人满意。因此开发一种高敏感性和特异性的肝癌诊断方法是亟待解决的问题。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种外周血exosome来源的肝癌诊断和预后标志物，所述标志物是exosome来源的Rab27A和/或Rab27B。本发明提供的标志物来源于人类外周血exosome，由于exosome具有选择性富集癌蛋白的作用，且受细胞膜的保护，在细胞间隙和外周血中不易被降解，因此本发明的标志物用于肝癌的诊断和预后敏感性更强。同时由于Rab27A和Rab27B在不同组织的表达模式存在明显的差异，反映了其组织特异性，因此本发明的标志物用于肝癌的诊断和预后特异性更强。

为了实现本发明的上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明提供了一种外周血exosome来源的肝癌诊断和预后标志物，所述标志 物是exsome来源的Rab27A蛋白和/或Rab27B蛋白。Rab27A和Rab27B两蛋白在肝癌患者血液exosome中表达相反的特点，将Rab27A/Rab27B比值作为肝癌早期诊断的指标比单独使用一种蛋白作为诊断指标的诊断率更高。