[发明专利]巴马哈森林病毒的实时荧光RT-PCR检测试剂盒和方法

说明书

技术领域

本发明属于病毒检测领域，具体涉及一种用于检测巴马哈森林病毒的实时荧光RT-PCR检测试剂盒和方法。

背景技术

巴马哈森林病毒(Barmah Forest virus，BFV)属于甲病毒属单链RNA病毒，1974年首次从澳大利亚环纹库蚊中分离出，主要传播媒介是伊蚊属蚊虫和致倦库蚊。BFV感染可出现发热、头痛及肌肉和关节疼痛等症状，有时出疹，通常是在身躯或四肢上。大量的生活史分析和序列分析证实该病毒属于甲病毒属塞姆利基森林病毒的分支。

现在虽然我国尚未分离到BFV，但鉴于我国存在有相关媒介蚊虫，且随着我国与世界其他国家之间的贸易、旅游、人员往来日益频繁，BFV通过各种途径传入的可能性很大。有相关报道人群中曾检测出BFV抗体，如贵州省健康人群BFV IgG抗体阳性率为1.49％，不明原因发热患者中检出BFV IgM阳性率为1.96％，提示我国人群可能存在该病毒的感染。

目前，针对BFV的检测方法有血清学、组织免疫学检测、RT-PCR检测方法，但是采用血清学或组织免疫学的检测方法，费时、费力，且检测灵敏度低，不能满足通关要求快速、高效、安全、低风险的目的；其次，RT-PCR检测方法检测灵敏度低，易出现假阴性结果。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一组用于检测巴马哈森林病毒的核酸。本发明的另一个目的是提供一种用于检测巴马哈森林病毒的实时荧光定量RT-PCR试剂盒及其检测方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种用于PCR检测巴马哈森林病毒的引物对，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。

一组用于检测巴马哈森林病毒的实时荧光RT-PCR核酸，该组核酸包括引物对、探针和作为阳性对照的扩增产物，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述扩增产物为包含有如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。

一种检测巴马哈森林病毒的实时荧光RT-PCR试剂盒，该试剂盒包括：

2×RT-PCR buffer；

25×RT-PCRenzymeMix；

上游引物：核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

下游引物：核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

探针：核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述探针的5＇端连接荧光基团，3＇端连接淬灭基团；

阴性对照：无核酸酶水；

阳性对照：包含有核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的基因。

如上所述的试剂盒，优选地，所述荧光基团为FAM、CY3、HEX中任意一种，所述淬灭基团为BHQ1、TAMRA、BHQ2中任意一种。

一种实时荧光RT-PCR方法检测巴马哈森林病毒的方法，该方法包括以下步骤：

(1)从样品中提取病毒RNA；

(2)对提取的RNA进行实时荧光RT-PCR扩增；其中，RT-PCR扩增时，反应体系采用上下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；

(3)收集荧光信号，选择上述荧光基团的荧光检测模式，基线调整取3～15个循环的荧光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；

(4)结果判定：待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈现良好的对数增长，则判断为阳性，如无典型的扩增曲线，判断为阴性。

如上所述的实时荧光RT-PCR方法检测巴马哈森林病毒的方法，优选地，所述步骤(2)中荧光RT-PCR扩增的反应体系具体如下：

1×RT-PCR Buffer，

1×RT-PCR Enzyme Mix，

上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，

其中，所述探针的5＇端连接荧光基团，3＇端连接淬灭基团；上下游引物和探针浓度分别为0.01～1μM样品RNA；同时设置无核酸酶水为阴性对照。

如上所述实时荧光RT-PCR方法检测巴马哈森林病毒的方法，优选地，上下游引物浓度为400nmol/L，探针的终浓度为200nmol/L。