[发明专利]免疫亲和柱净化-液相色谱-串联质谱测定海洋生物中河豚毒素的方法

权利要求书

1.一种免疫亲和柱净化-液相色谱-串联质谱测定海洋生物中河豚毒素的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)样品处理：准确称取已充分均质样品2.00g于50mL具塞离心管中，加入10mL含有1％乙酸的甲醇溶液，涡旋振荡2min，60℃水浴超声提取15min，冷却至室温后，6000r/min离心5min，移取5mL上清液至另一50mL离心管中，加入20ml PBS溶液进行稀释，用1mol/L氢氧化钠溶液调节PH至7～8，得样品液；

(2)免疫亲和柱净化：免疫亲和柱上样品液，上样结束后，用水淋洗亲和柱，挤干柱内残留液，并弃去以上全部流出液，最后用含有1％乙酸的甲醇溶液洗脱，收集的洗脱液于60℃氮气吹干，用1mL流动相定容溶解得净化液；

(3)液相色谱-质谱分析：净化液经滤膜过滤后供液相色谱-串联质谱仪测定获得河豚毒素的峰面积，将峰面积代入标准曲线分析计算，从而获得样品中河豚毒素的含量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中流动相配比为：含0.1％甲酸的5mmol/L乙酸铵溶液：乙腈＝5％:95％。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中色谱条件为：色谱柱：ACQUITYUPLC BEH Amide柱；样品室温度10℃；柱温40℃；进样体积10μL；流速0.3mL/min；流动相A为含0.1％甲酸的5mmol/L乙酸铵溶液，B为乙腈，梯度洗脱：0～1.5min，5％～80％A；1.5～3.0min，80％A；3.0～3.5min，80％～5％A；3.5～5min，5％A。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中质谱条件为：电喷雾离子源，正离子扫描；检测方式：多反应监测；毛细管电压：3.0kV；离子源温度：110℃；脱溶剂气温度：350℃；锥孔气流量：50L/h；脱溶剂气流量：600L/h。

5.根据权利要求1-4任意一项所述的方法，其特征在于：步骤(3)中标准曲线的制作方法为：配制浓度为0.3μg/L、1.0μg/L、2.0μg/L、5.0μg/L、10.0μg/L和20.0μg/L的标准工作溶液，以TTX浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，制作标准曲线。