[发明专利]猴病毒40衣壳蛋白VP1在作为细胞穿膜蛋白中的应用

说明书

本发明公开了猴病毒40衣壳蛋白VP1在作为细胞穿膜蛋白中的应用。首先揭示了VP1是一种细胞穿透蛋白，将VP1蛋白与其他蛋白融合表达，VP1可以携带外源蛋白穿透细胞膜，进入细胞并定位于细胞质。本发明实验证实VP1蛋白可携带mCherry荧光蛋白及抑癌蛋白P53穿透细胞膜，进入细胞并定位于细胞质。本发明提供了一种简单高效的细胞转导系统，并且实现了在细胞质中的亚细胞定位，所构建的VP1‑P53蛋白还有望在肿瘤治疗等方面有潜在应用。

技术领域

本发明涉及细胞转导技术领域，更具体涉及猴病毒40衣壳蛋白VP1在作为细胞穿膜蛋白中的应用。猴病毒40主要衣壳蛋白VP1能够穿透哺乳动物细胞膜，进入细胞内并定位于细胞质中。将SV40 VP1蛋白与其它蛋白相融合，VP1可以把与其融合的外源蛋白转导进入细胞并定位于细胞质。

背景技术

随着分子生物学理论与技术的发展，以基因治疗、靶向蛋白质药物或多肽药物为主的新的分子治疗措施应运而生，但是这些治疗手段往往以向细胞内输送大分子物质为前提。由于细胞膜的选择透过性作用，蛋白质、多肽和DNA等极性强及分子量大的物质不能自由穿过,必须借助特殊的转运机制或一定的生物学手段才能进入细胞内。传统的介导外源物质进入细胞的技术包括电穿孔、微注射、病毒运输系统、反复冻融技术、脂质体包裹等，但因为这些技术损伤性强、毒性大、效率低而在应用上受到很大限制。另外，药物进入细胞后因为溶酶体的降解,实际利用度往往非常低。因此，寻找更加有效的运输载体是当前药物治疗迫切需要解决的课题。

近二十年来，具有细胞穿透能力的蛋白质与细胞穿透肽的发现给细胞内药物运输带来了希望。细胞穿透蛋白质或细胞穿透肽具有强大的细胞穿透能力，自身能够穿透细胞膜进入细胞内。到目前为止，许多细胞穿透蛋白质或细胞穿透肽已经被发现。细胞穿透蛋白质或细胞穿透肽可以分为两大类：第一类需要与药物共价连接后细胞携带药物内化进入细胞，第二类与药物形成稳定的非共价复合物，携带药物进入细胞。细胞穿透蛋白质或细胞穿透肽能够可以携带多种物质，包括亲水性蛋白、多肽、DNA甚至颗粒性物质进入细胞，甚至可以携带其进行细胞间或细胞内的运输，并且不受细胞类型的限制，在细胞生物学、基因治疗学以及药学等领域具有巨大潜力。在转导入细胞后，能快速地从内涵体中释放，到达靶标，具有高效性，没有细胞毒作用，免疫原性低等优点，在物质运输领域得到广泛的应用。

目前一些具有穿透细胞膜功能的蛋白质已经用于外源物质的运输，如HIV-1 Tat蛋白、果蝇触角足同源蛋白(pANTP)和HSV-1 VP22等。历史上第一个显示蛋白质可能包含负责穿透细胞膜的序列是在1988年来自对HIV-1 Tat蛋白86个氨基酸长度的片段(Tat-86)被活细胞内化的观察。Frankel和Pabo发现HIV-1的转录激活因子Tat蛋白可以进入细胞并转导到细胞核里。1991年Prochiantz研究小组证明60个氨基酸的果蝇触角足蛋白(Drosophila Anten napedia homeoprotein,pANTP)能够穿透细胞膜，被神经细胞内化。这个研究工作是后来在1994年发现第一个PTD或者叫CPP的起源。为了理解果蝇触角蛋白的内化驱动力，对其同源域进行点突变，发现它的第三个螺旋结构是膜转位的必要和充分条件，结果把这16个氨基酸长的CPP叫做穿透肽penetratin(RQIKIYFQNRRMKWKK)后来改称为pAntp。很快其他CPPs例如HIV-1 Tat蛋白的基本序列，运输子嵌合多肽和人工合成的两性分子模型多肽陆续被发现。

1998年Lebleu研究小组定义了Tat被细胞摄取所需要的最小肽段序列(47YGRKKRRQRRR57)。1997年，Heitz和Divita研究小组设计出第一个非共价CPP运输核酸MPG进入细胞，紧接着又利用Pep-1运输蛋白质和多肽进入细胞。Wender和Futaki两个研究小组证明聚精氨酸序列(Arg8)可以携带分子进入细胞，进而提出它们的摄取机制包括精氨酸胍盐基团和细胞膜上的磷酸基团的二氢键相互作用。CPP研究领域最重要的突破来自它们在或体内的第一个应用。Dowdy研究小组利用CPP运输小肽和大蛋白质进入体，Lange利用运输子嵌合多肽运输PNAs。自此，许多其他的CPPs都被设计出来携带外源物质跨过细胞膜进入细胞质。