[发明专利]一种用于检测UGT1A1基因多态性的引物、探针、试剂盒及检测方法有效
申请号: | 201410604304.9 | 申请日: | 2014-10-30 |
公开(公告)号: | CN104328181A | 公开(公告)日: | 2015-02-04 |
发明(设计)人: | 林佳;李品;霍然;唐景峰 | 申请(专利权)人: | 武汉百泰基因工程有限公司 |
主分类号: | C12Q1/68 | 分类号: | C12Q1/68;C12N15/11 |
代理公司: | 北京三高永信知识产权代理有限责任公司 11138 | 代理人: | 徐立 |
地址: | 430223 湖北省武汉市东*** | 国省代码: | 湖北;42 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 用于 检测 ugt1a1 基因 多态性 引物 探针 试剂盒 方法 | ||
技术领域
本发明涉及生物技术领域,特别涉及一种用于检测UGT1A1基因多态性的引物、探针、试剂盒及检测方法。
背景技术
伊立替康(irinotecan,CPT-11)是喜树碱半合成衍生物,伊立替康在体内经竣酸酯酶(carboxylesterases,CE)水解转化为7-乙基-10-羟基喜树碱(7-ethyl-10-hydroxy-camptothecin,SN-38),伊立替康是治疗转移性结直肠癌(metastatic colorectal cancer,mCRC)最有效的化疗药物之一。伊立替康经静脉注射后,在体内转化为细胞毒性更强的活性代谢产物SN-38后,经尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶家族(uridine diphosphate glucuronosyltransferases,UGTs)灭活为葡萄糖醛酸产物(10-O-glucuronyl-SN-38,SN-38G)后,经胆汁排泄入肠,在肠道细菌β-葡萄糖醛酸酶作用下转换为SN-38后能够引发肠黏膜损伤及迟发性腹泻;而肠道内的UGTs酶又可再度催化SN-38为SN-38G解毒,人类的UGTs被分为UGT1和UGT2两个家族,UGT1基因至少包括13个亚型其中包括UGT1A1,其中UGT1A1基因多态性的表达及其活性与伊立替康的疗效及不良反应均密切相关。
UGT1A1基因启动子区TATA盒区域的变化,在CPT-11治疗中,UGT1A1*28等位基因的存在导致活性代谢产物SN-38的显著增加,从而发生腹泻或中性粒细胞减少的几率显著增加。提示UGT1A1基因型的检测可用于临床预测与CPT-11相关的严重毒副作用的发生。同时,在亚洲人群应用伊立替康进行治疗的患者中UGT1A1*6(第1外显子211位)杂合突变型G/A和纯合突变型A/A显著增加患者发生3~4级中性粒细胞减少、血小板减少及腹泻的风险,针对以上突变的患者临床需减少伊利替康给药剂量,以控制毒副作用,通过对人UGT1A1基因启动子区TATA盒区域和第1外显子211位核苷酸基因多态性进行检测,从基因水平上预测伊利替康对肿瘤患者的毒副作用,为临床医生制定伊利替康的给药剂量提供参考。
目前基因突变检测的“金标准”仍然是测序法,但传统的测序方法步骤繁琐,操作时间长,同时,测序法检测的灵敏度低,不能准确检测出UGT1A1基因的多态性,使用者迫切需要一种高灵敏度的检测方法替换Sanger测序法
发明内容
为了解决现有技术中检测UGT1A1基因多态性的方法的灵敏度低的问题,本发明实施例提供了一种用于检测UGT1A1基因多态性的引物、探针、试剂盒及检测方法。所述技术方案如下:
一方面,本发明实施例提供了一种用于检测UGT1A1基因多态性的引物和探针,所述用于检测UGT1A1基因多态性的引物和探针包括用于检测所述UGT1A1*6基因多态性的UGT1A1*6多态性的引物和探针、以及用于检测所述UGT1A1*28基因多态性的UGT1A1*28多态性的引物和探针中的至少一种,所述引物包括:正向引物和反向引物,其中,
UGT1A1*6多态性的正向引物如序列表中SEQ ID NO.1所示;
UGT1A1*6多态性的反向引物如序列表中SEQ ID NO.2所示;
UGT1A1*6多态性的探针如序列表中SEQ ID NO.3所示;
UGT1A1*28多态性的正向引物如序列表中SEQ ID NO.4所示;
UGT1A1*28多态性的反向引物如序列表中SEQ ID NO.5所示;
UGT1A1*28多态性的探针如序列表中SEQ ID NO.6所示;
所述探针的5’端均连接有FAM荧光基团,所述探针的3’端均连接有BHQ淬灭基团。
另一方面,本发明实施例提供了一种用于检测UGT1A1基因多态性的试剂盒,所述试剂盒包括:上述的引物和探针。
具体地,所述试剂盒还包括:PCR反应液、阳性质控品、阴性质控品、测序反应液、消化酶系和测序PCR产物纯化试剂。
具体地,所述PCR反应液包括:含Mg2+的5×PCR缓冲液5μl、2.5mmol/L dNTPs 1.5μl、5U/μl Taq酶0.2μl和20ng/μl的模板DNA 2μl。
具体地,所述消化酶系包括碱性磷酸酶和核酸外切酶Ⅰ。
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