[发明专利]同步检测五种猪病毒的液相基因芯片的核酸及其检测方法

权利要求书

1.一组用于同步检测鉴别五种猪病毒的液相基因芯片的核酸，其特征在于，包括猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)和猪细小病毒(PPV)五种猪病毒的上、下游引物和杂交探针，其中，

所述PRRSV的上游引物序列如SEQ ID No.1所示，该上游引物序列5’端标记生物素，下游引物序列如SEQ ID No.2所示，杂交探针如SEQ ID No.3所示；

所述PCV-2的上游引物序列如SEQ ID No.5所示，下游引物序列如SEQ ID No.6所示，该下游引物5’端标记生物素，杂交探针如SEQ ID No.7；

所述PRV的上游引物序列如SEQ ID No.9所示，下游引物序列如SEQ ID No.10所示，该下游引物5’端标记生物素，杂交探针如SEQ ID No.11所示；

所述CSFV的上游引物序列如SEQ ID No.13所示，下游引物序列如SEQ ID No.14所示，该下游引物5’端标记生物素，杂交探针如SEQ ID No.15所示；

所述PPV的上游引物序列如SEQ ID No.17所示，下游引物序列如SEQ ID No.18所示，该下游引物5’端标记生物素，杂交探针如SEQ ID No.19所示；

其中，所述SEQ ID No.2的第10个碱基i为次黄嘌呤，所述SEQ ID No.3的第13位碱基i为次黄嘌呤；

所述五种猪病毒的杂交探针的5’端均标记氨基。

2.如权利要求1所述的核酸，其特征在于，该组核酸还包括检测PRRSV、PCV-2、PRV、CSFV和PPV的阳性扩增产物序列，其中，

所述检测PRRSV的阳性扩增产物序列，如SEQ ID No.4所示的序列；

所述检测PCV-2的阳性扩增产物序列，如SEQ ID No.8所示的序列；

所述检测PRV的阳性扩增产物序列，如SEQ ID No.12所示的序列；

所述检测CSFV的阳性扩增产物序列，如SEQ ID No.16所示的序列；

所述检测PPV的阳性扩增产物序列，如SEQ ID No.20所示的序列。

3.用于同步检测鉴别五种猪病毒的液相基因芯片的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1或/和权利要求2所述的核酸。

4.一种同步检测鉴别PRRSV、PCV-2、PRV、CSFV和PPV五种猪病毒的液相基因芯片检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)、提取待检样品的核酸；

(2)、利用如权利要求1中所述检测鉴别PRRSV、PCV-2、PRV、CSFV和PPV五种猪病毒的液相基因芯片的上、下游引物对上述步骤(1)提取的待检样品的核酸进行不对称RT-PCR扩增，获得扩增产物；

(3)、利用如权利要求1中所述PRRSV、PCV-2、PRV、CSFV和PPV的杂交探针，与步骤(2)获得的扩增产物进行杂交反应；

(4)、用液相芯片仪检测步骤(3)杂交反应后的荧光值，根据检测的本底值，判定检测结果；

其中，

所述本底值的设定：同步平行设定3个空白对照进行上述步骤(2)、步骤(3)的反应，其中在所述空白对照，用水取代待测样品模板，其余试剂成分与反应条件不变；计算3个空白对照的测得荧光值的平均值，作为本底值；

结果判定：将被检样品的MFI值减去本底值，作为样品的MFI净值；当被检样品的MFI净值大于或等于2倍本底值时，判为阳性，否则判为阴性。

5.如权利要求4所述的液相基因芯片检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述PCR扩增的扩增体系，包括PRRSV、PCV-2、PRV、CSFV和PPV五种病毒上下游引物、Mg²⁺、dNTP、PCR缓冲液、反转录酶和Taq聚合酶混合酶(RT/Taq mix)、待检样品模板和水；

所述PRRSV上游引物的终浓度为800nmol/L，下游引物的终浓度为100nmol/L；PCV-2上游引物的终浓度为40nmol/L，下游引物终浓度为400nmol/L；PRV上游引物终浓度为100nmol/L，下游引物终浓度为800nmol/L；CSFV上游引物终浓度为40nmol/L，下游引物终浓度为400nmol/L；PPV上游引物终浓度为40nmol/L，下游引物终浓度为200nmol/L；

所述PCR扩增的扩增反应条件为：反应温度为50℃，反应15分钟进行反转录；94℃预变性2分钟；接着进行PCR循环反应：94℃变性10秒，55℃退火15秒，72℃延伸10秒，共进行40个循环；最后72℃延伸1分钟；

所述步骤(3)包括：

a.将所述5种猪病毒的杂交探针偶联到聚苯乙烯乳胶微球，所述聚苯乙烯乳胶微球带有COOH；

b.将步骤(1)获得的扩增产物与上述步骤a中偶联聚苯乙烯乳胶微球的杂交探针进行杂交反应；

c.杂交反应后，进行洗涤，之后加入链亲和素藻红蛋白(SAPE)进行温育，

d.取温育的混合液，检测荧光值；

其中，所述步骤b中杂交反应的条件为95℃，5min，57℃，300rpm，恒温杂交10min；所示步骤c加入所述SAPE的浓度6.7μg/mL，室温57℃温育10min。