[发明专利]一种诱导小鼠胚胎干细胞分化内耳毛细胞的方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种内耳毛细胞的分化方法，特别涉及一种诱导小鼠胚胎干细胞分化获得内耳毛细胞的方法。

(二)背景技术

听力损失是严重影响人类生活质量的世界性顽疾之一，目前尚无根治方法。哺乳动物内耳毛细胞的不可修复损伤被认为是导致听力损失的最主要原因之一。传统观点认为，人类内耳听觉毛细胞为特化终末细胞，不再具有再生修复能力，其损伤是不可逆的。近年来研究发现哺乳动物胚胎期或早期毛细胞有可能再生，并且通过转染促毛细胞分化发育相关基因在成年耳蜗中发现不成熟毛细胞的异位发生，提示了哺乳动物毛细胞在一定诱导条件下实现再生的可能性，但对于病变过程中毛细胞的修复再生仍存在很大挑战。因此寻找毛细胞再生的前体细胞来源，以便开发毛细胞损伤修复干预策略是听力损失治疗的当务之急。

干细胞以其全能或多能性以及高度的自我增殖能力等诸多优点而成为组织工程和细胞治疗领域研究的热点。近年来越来越多研究展示了胚胎干细胞和各种来源的成体干细胞在组织损伤修复和疾病治疗研究中的极大优势和应用潜能，以干细胞诱导分化为基础，利用干细胞相关技术，探讨听觉系统损伤修复特别是毛细胞的损伤和再生已成为可能。同时，由于毛细胞数量稀少，对于毛细胞发育的分子机制研究仍然非常有限。因此，探索建立有效的干细胞分化毛细胞诱导体系，不仅能为毛细胞再生治疗提供有效细胞来源，而且将为探讨毛细胞分化发育相关分子和信号机制提供研究模型。胚胎干细胞具有体外培养无限增殖、自我更新和分化全能性等优点，是干细胞分化领域的重点。本发明利用胚胎干细胞，建立了一种条件培养液、细胞因子和滋养层细胞相结合有效诱导分化内耳毛细胞的方法。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种诱导小鼠胚胎干细胞分化获得内耳毛细胞的方法，本发明方法首先用条件培养液和诱导培养液诱导胚胎干细胞分化毛细胞前体细胞；然后利用诱导培养液与滋养层细胞(即鸡胚椭圆囊间质细胞)结合的方法诱导前体细胞分化成熟内耳毛细胞，通过本方法诱导，能够得到高比例的毛细胞前体细胞和成熟内耳毛细胞。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种诱导小鼠胚胎干细胞分化内耳毛细胞的方法，所述的方法为：(1)将小鼠胚胎干细胞接种至条件培养液，在37℃、5％CO₂条件下培养4-5天，形成细胞团；取细胞团转移至诱导液Ⅰ中，在37℃、5％CO₂条件诱导培养12-14天，获得胚胎干细胞分化的毛细胞前体细胞；所述条件培养液终浓度组成为：体积浓度30-50％HepG2条件培养液、1mM非必需氨基酸、5μMβ-巯基乙醇、2mM L-谷氨酰胺、体积浓度10％FBS(胎牛血清)，溶剂为DMEM/F12基础培养液；所述HepG2条件培养液按如下方法制备：将HepG2细胞以5×10⁴cells/cm²密度接种于培养皿中，按1.75×10⁵cells/mL培养液的量加入含体积终浓度10％FBS的DMEM培养液，置于37℃、5％CO₂条件下培养4-5天后收集上层培养液，离心除去细胞碎片，获得上层清液和下层沉淀，弃去下层沉淀，取上层清液经抽滤(优选0.22μm滤膜抽滤)，滤液即为HepG2条件培养液；所述诱导液Ⅰ终浓度组成为：体积浓度5％FBS、5-15ng/ml IGF-1(胰岛素样生长因子-1)、20-30ng/ml EGF(表皮细胞生长因子)、1×N2、1×B27、45-55ng/mL FGF3(成纤维细胞生长因子3)、45-55ng/mL FGF10(成纤维细胞生长因子10)、45-55ng/mL肝素钠，溶剂为DMEM/F12基础培养液；

(2)将鸡胚椭圆囊间质细胞(优选生长至90％汇合度的鸡胚椭圆囊间质细胞)用含终浓度2μg/ml丝裂霉素C的DMEM培养液浸泡，在37℃，5％CO₂培养箱中培养3小时，弃去培养液，细胞用pH值为7.4的PBS缓冲液洗涤，即为预处理后的鸡胚椭圆囊间质细胞；