[发明专利]一种从病人痰液中提取小分子α防御素多肽的方法

权利要求书

1.一种从病人痰液中提取小分子α防御素多肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)收集病人的痰液，并保存在冰水混合物状态；

(2)向步骤(1)得到的痰液中加乙酸匀浆，4℃过夜搅拌浸提，离心，弃沉淀，取上清，制备粗提物；

(3)向步骤(2)中得到的粗提物中加入DTT，混匀；

(4)将步骤(3)得到的混合物上样于Pullulan P-10凝胶柱，用乙酸洗脱，用自动收集器直接收集洗脱液到各收集管内，每管10mL；经蛋白质检测仪监测在波长620nm的吸光度，并制作出洗脱曲线；根据洗脱曲线，从开始点和第一个高峰点收集到的洗脱液中取样进行蛋白分子质谱分析定性；

(5)将步骤(4)收集的洗脱液超滤浓缩，得到小分子多肽，真空冻干保存；

(6)用步骤(5)得到的小分子多肽做蛋白氨基酸测序，并用琼脂糖弥散法检测其对大肠杆菌的抗菌活性。

2.根据权利要求1所述一种从病人痰液中提取小分子α防御素多肽的方法，其特征在于，步骤(1)中，收集病人痰液过程中，一直用干冰保持痰液在冰水混合物状态，并在-80℃下保存至纯化提取。

3.根据权利要求1所述一种从病人痰液中提取小分子α防御素多肽的方法，其特征在于，步骤(2)的具体步骤为：向步骤(1)得到的痰液中按体积比为1:1的比例加入体积分数为10％的乙酸冰水混合物，用匀浆器制备痰液匀浆，搅拌混匀，并于4℃冰箱内旋转过夜，然后在4℃下，14000rpm离心30min，去沉淀，留上清为粗提物。

4.根据权利要求1所述一种从病人痰液中提取小分子α防御素多肽的方法，其特征在于，步骤(3)中，向步骤(2)得到的粗提物中按1:10的体积比加入0.2mM DTT，混匀。

5.根据权利要求1所述一种从病人痰液中提取小分子α防御素多肽的方法，其特征在于，步骤(4)中，将步骤(3)得到的混合物上样于Pullulan P-10凝胶柱，用乙酸冲洗凝胶柱，所述Pullulan P-10凝胶柱的尺寸为2.5cm×120cm。

6.根据权利要求1所述一种从病人痰液中提取小分子α防御素多肽的方法，其特征在于，步骤(4)中，用于洗脱的乙酸体积分数为5％，洗脱过程于室温下，利用重力自然完成。

7.根据权利要求1所述一种从病人痰液中提取小分子α防御素多肽的方法，其特征在于，步骤(4)中，选取洗脱液样本，经质谱分析确定其分子量为3442.57kD，等同于α防御素多肽的分子量。

8.根据权利要求1所述一种从病人痰液中提取小分子α防御素多肽的方法，其特征在于，步骤(6)中，用步骤(5)中超滤浓缩后得到的小分子多肽经琼脂糖弥散法检测，测得其对大肠杆菌具有抗菌活性。

9.根据权利要求1至8任一项所述一种从病人痰液中提取小分子α防御素多肽的方法，其特征在于，步骤(6)中，所述蛋白氨基酸测序的具体步骤为：将步骤(5)得到的有抑菌作用的洗脱液进行Tricine-PAGE纯化，蛋白条带转印至PVDF膜，采用sanger水解逐段分析法做氨基酸分析；若得出氨基酸序列为Ala-Cys-Tyr-Cys-Arg-Ile-Pro-Ala-Cys-Ile-Ala-Gly-Glu-Arg-Arg-Tyr-Gly-Thr-Cys-Ile-Tyr-Gln-Gly-Arg-Leu-Trp-Ala-Phe-Cys-Cys，则证明提取出的小分子多肽即为α防御素。

10.根据权利要求9所述一种从病人痰液中提取小分子α防御素多肽的方法，其特征在于，所述Tricine-PAGE纯化的浓缩胶为5％T、3％C、80V、20min，分离胶为15％T、6％C、100V、2h，并将大于3kD小于5kD的蛋白条带转印至PVDF膜。