[发明专利]嗜肺军团菌Ⅰ型检测试剂盒及嗜肺军团菌Ⅰ型检测方法

说明书

技术领域

本发明属于卫生防预病毒检测技术领域，具体的涉及一种嗜肺军团菌Ⅰ型检测试剂盒及嗜肺军团菌Ⅰ型的检测方法。

背景技术

军团病是近20年以来新发现的传染病之一，并且该病已成为世界各国及我国普遍关注的公共卫生问题。嗜肺军团菌是引起人类军团病的主要病原菌，现已发现有14个血清型，其中嗜肺军团菌Ⅰ型是最常见的现感染型。嗜肺军团菌(legionella pneumophila)为军团菌属的短小球杆菌，又名退伍军人杆菌。嗜肺军团菌可入侵变形虫，或是人类的巨噬细胞内。主要存在于温暖潮湿的自然环境，也广泛分布于人工供水系统中。其专性需氧，在自然界可长期存活，如在蒸馏水中可存活100天以上，污水中可存活一年，对热和一般消毒剂敏感。人们通常是由于呼吸了被军团杆菌污染的水源散发的水雾而感染。轻微感染者会出现发烧和肌肉痛等症状，严重感染者甚至可能引发肺炎。

目前国内外的军团菌检测方法主要依据ISO11731-1:1998；ISO 11731-2：2004(E)、《军团菌的检测和计数》及《公共场所集空调通风系统卫生管理办法》。定性测试两种方法的检测步骤大致相同，基本包括以下步骤：

(1)采样及运送：

采样容器可为无菌玻璃瓶,聚乙烯瓶或无菌采样袋，并且瓶口或袋口能密封；采样量一般在300-400ml左右，如果经过氯或臭氧消毒的水，采样后加入少量硫代硫酸钠溶液，以中和样品中的氧化物；采样至送达实验室最长时间不得超过2天。

(2)样品处理：

对含少量军团菌的样品一般用薄膜过滤法来浓缩样品的浓度，如有杂质的样品可静置沉淀或离心过滤去除，并对样品进行热处理和酸处理以减少非军团菌的生长。

(3)接种和培养：

军团杆菌在分类学上是一种独特的需氧革兰氏阴性杆菌，无荚膜，在普通培养基上不生长，属于细胞内寄生菌。目前标准培养基为活性碳酵母浸膏琼脂平板，也称军团菌生长平板(BCYE)。接种在BCYE平板上的样品在温度为35-37℃，培养10天，在浓度为2.5％CO₂的环境下培养更有利于军团菌的生长。军团菌的菌落通常呈白色、灰色、有荧光。

(4)军团菌的鉴定：

挑取至少3个疑似军团菌的菌落接种至军团菌生长BCYE平板和半光氨酸缺失的BCYE-Cys平板，在35-37℃条件下培养至少5天，凡是在BCYE平板上生长而在平板和半光氨酸缺失BCYE-Cys平板上不生长，并且血清学阳性的的则判为军团菌。

根据上述目前的检测方法，检测样品中军团菌的周期过长(至少15天以上)、操作烦琐、灵敏度低、易污染、程序复杂和所需试剂繁多、挑取疑似军团菌菌落的失误性高等缺点已远远不能满足快速检测的要求。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种嗜肺军团菌Ⅰ型检测试剂盒和嗜肺军团菌Ⅰ型检测方法。旨在解决现有嗜肺军团菌Ⅰ型周期长、灵敏的低等技术问题。

为了实现上述发明目的，本发明实施例的技术方案如下：

一种嗜肺军团菌Ⅰ型检测试剂盒，包含PCR反应液，所述PCR反应液包含彼此被分开的第一反应液、含有酶的第二反应液，所述第一反应液包含用于荧光定量PCR的嗜肺军团菌Ⅰ型靶基因的引物探针。

一种嗜肺军团菌Ⅰ型的检测方法，包括如下步骤：

提取待测样本DNA；

以所述提取待测样本DNA为模板，采用如上述的嗜肺军团菌Ⅰ型检测试剂盒进行PCR反应后收集荧光数据；

将荧光信号检测结果与对照组比较判断。

本发明与现有技术相比，具有以下优异技术效果：

上述嗜肺军团菌Ⅰ型检测试剂盒能将含有嗜肺军团菌Ⅰ型靶基因的引物探针的第一反应液与含有酶的第二反应液在检测时直接混合进行PCR反应，能快速的检测嗜肺军团菌Ⅰ型，且能避免污染，灵敏度高，有效避免了传统检测嗜肺军团菌Ⅰ型的周期长，易污染且灵敏度低的不足。

上述嗜肺军团菌Ⅰ型检测方法利用上述嗜肺军团菌Ⅰ型检测试剂盒进行实时荧光PCR反应，显著缩短了嗜肺军团菌Ⅰ型检测的时间和检测质量，克服了目前传统嗜肺军团菌Ⅰ型检测方法存在的不足，弥补了目前应急应对预防和控制传染病毒感染症候病因学确认等领域存在的缺陷和不足，具有重要的实用价值和现实推广意义。

附图说明

图1为本发明实施例使用的Ct值的示意性说明，其中所述的阈值线对应于特定探针；

图2为使用本发明实施例嗜肺军团菌Ⅰ型检测方法流程图；