[发明专利]一种提高猪细胞重编程能力的方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种提高猪细胞重编程能力的方法及应用，属于细胞移植和胚胎发育技术领域。

背景技术

体细胞核移植技术是一种细胞重编程技术，自从克隆羊“Dolly”诞生以来，该技术先后在多种哺乳动物上取得成功，但克隆效率普遍很低，平均在0.1％-2.0％之间。为提高核移植效率，研究人员在核移植技术程序、卵母细胞成熟质量、体外胚胎培养条件、供核细胞的筛选和预处理等方面进行了大量的研究，虽然取得了一定进展，但克隆效率仍然有待提高。目前认为克隆效率低下的最主要原因是体细胞核重编程不完全。体细胞核重编程是指供体细胞核移入卵母细胞后停止本身的基因表达程序，恢复为胚胎发育所必需的特定基因表达程序。这个过程主要是卵母细胞对供体细胞表观遗传修饰进行重新编写，其中包括染色体重塑、DNA甲基化重建、组蛋白修饰改变和印记基因表达调控等。如果体细胞核移植过程中，供体细胞的组织特异的表观遗传修饰不能被有效地消除，将会影响胚胎的正常发育。因此促进体细胞核表观遗传重编程将有助于提高核移植效率。

目前，已经发现了一些药物处理供体细胞或克隆胚胎能够在一定程度上提高克隆效率，如甲基化或去乙酰化抑制剂(5-氮胞苷(5-AZA-dC)，曲古抑菌素A(TSA))。5-AZA-dC和TSA通过促进甲基化和乙酰化水平的重编程来提高克隆效率。但这些药物都没有彻底解决克隆效率低下的问题。

采用甲基化或去乙酰化抑制剂处理供体细胞或克隆胚胎，通过调节甲基化和乙酰化水平不能有效的提高克隆效率的原因是：导致克隆胚胎发育率低下的核移植重编程异常是多方面的，不止包括甲基化和乙酰化水平异常，虽然甲基化或去乙酰化抑制剂的预处理能够改善核移植重编程的某些方面，但要想让克隆效率达到一个更高水平，人们必须从更多角度进行探索促进核移植重编程的方法。

H3K27me3是一种重要的组蛋白修饰，对基因表达有抑制作用。在猪体外受精胚胎(IVF)中，H3K27me3在1-cell位于雌原核中，在2-cell以后水平急剧下降，4-cell以后一般检测不到其存在，直到晚期囊胚才在滋养层细胞中又开始出现。人们一般认为H3K27me3在早期胚胎的迅速擦除有利于早期胚胎(特别是合子基因激活)时期的基因表达。但在猪克隆胚胎中，H3K27me3的分布情况，即H3K27me3是否被有效的重编程还没有被报道。

诱导多能性干细胞(iPS)技术是体细胞核移植技术以外另一种细胞重编程技术。它通过人为向细胞中导入几个外源基因使细胞命运发生改变。但是目前iPS技术诱导效率普遍偏低。虽然iPS技术和核移植技术的技术路径和原理有着很大的不同，但是这两种方法的重编程过程却有着很大的相似性，都需要克服源头细胞的分化状态的表观修饰来达到多能性状态。所以提高克隆效率的方法也有可能能够提高iPS诱导效率。

GSK126是一种高效和特异性的EZH2的小分子抑制剂，能够降低H3K27me3的整体水平，GSK126可以作为治疗EZH2突变的淋巴瘤的药物。但是，在重编程领域一直没有应用，目前尚未发现GSK126可用于提高胚胎发育或iPS诱导效率的作用。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种提高猪细胞重编程能力的方法，采取的技术方案如下：

一种提高猪细胞重编程能力的方法，是在获取并培养猪卵母细胞和猪胎儿成纤维细胞后，进行体细胞核移植，最后进行iPS诱导并进行碱性磷酸酶染色，其特征在于，以下列任意一种方式使用小分子药物GSK126：

1)猪胎儿成纤维细胞在核移植前利用小分子药物GSK126进行处理；

2)在猪胎儿成纤维细胞体细胞核移植后，利用小分子药物GSK126处理融合胚胎；

3)用于iPS诱导的猪胎儿成纤维细胞，在培养成熟后接种前利用小分子药物GSK126进行处理。

1)中所述利用小分子药物GSK126进行处理，是利用0.5-3.0μM的GSK126处理40-50h。

优选地，1)中所述利用小分子药物GSK126进行处理，是利用0.5μM的GSK126处理48h。

2)中所述利用小分子药物GSK126进行处理，是利用0.05-0.15μM的GSK126处理18-30h。

优选地，2)中所述利用小分子药物GSK126进行处理，是利用0.1μM的GSK126处理24h。

所述方法用于提高克隆胚胎的发育率。

3)中所述利用小分子药物GSK126进行处理，是利用0.5-3.0μM的GSK126处理40-50h。