[发明专利]一种获取植物雄蕊表达启动子STA3的方法及相应启动子

说明书

技术领域

本发明涉及一种从植物中分离的启动子，尤其涉及从水稻中分离的雄蕊特异表达启动子，本发明还涉及含有该雄蕊特异表达启动子的重组表达载体、宿主细胞以及在改良植物性状、培育植物新品种等方面的应用，属于植物组织或器官特异性表达启动子的分离及其应用领域。

背景技术

植物生长过程中，基因表达的开启、关闭、表达模式、表达丰度的高低往往会受到精细细胞的调控。基因的表达调控是一个多层次的复杂过程，受不同的调节因素控制，也是在多阶段水平来实现的。尽管基因表达在高等生物中是多级调控系统，但是转录水平上的调控是最关键的环节。启动子作为转录水平上一个重要的调控元件，是众多转录因子及RNA聚合酶的最终作用靶标，因此，深入研究启动子的结构、功能和作用模式等具有重大意义(Xu et al.,2011；yamamoto et al.,2011)。

通过分子生物学以及基因工程的手段去研究和改良作物在农业生产中具有很好的应用前景(林拥军，2001)。但是在其广泛运用的过程中也逐渐暴露了一些问题，由于组成型启动子会使驱动的目的基因在受体植物各组织中持续而恒定的表达，所以有时会带来一些负面效应，如增加代谢负担以及一些食品安全性方面的担忧等等(Conner et al.,2003；Kuiper et al.,2001)。为此，随着植物基因工程的发展，人们寻找更为有效的组织、器官特异性表达启动子来代替组成型表达启动子，以更好地调控目的基因的表达。在组织特异型启动子调控下，基因的表达常常只发生在某些特定的器官或组织部位，并常常表现出发育调节的特性。目前，组织器官特异启动子的研究已经取得了很大的进展。

雄蕊是高等植物生殖器官的重要组成部分，雄蕊的形成是一个十分复杂的过程，在这个过程中，大量基因的协同表达受到不同启动子的调节和控制，其中花药特异表达启动子和花粉特异表达启动子起到了十分重要的作用。Orys1是一个水稻来源的花粉过敏原基因，Azria等分离克隆了其启动子，然后在澳大利亚本地的水稻栽培种中做了功能验证，证实其启动子具有花粉中特异表达的特性(Azria and Bhalla,2011)。Zhou等分离克隆了一个来源于马铃薯的花粉特异表达基因SBgLR的启动子，研究发现一个18bp长的回文对称序列在控制花粉特异表达过程中起非常重要的作用(Zhou et al.,2010)。END1是从豌豆中分离得到的一个花药特异表达基因，GUS组织化学分析表明END1启动子可以驱动GUS基因在烟草、拟南芥、番茄等植物的花药中特异表达。

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，亦是禾本科作物功能基因组学研究的模式植物(Zhang,2007)，启动子是精确调控基因表达的“开关”。在过去的几年里，尽管克隆了一些组织特异表达启动子，但是这些组织特异表达的调控机理仍然很不清楚，用于作物遗传改良的高丰度表达特异启动子仍然较少。因此对水稻组织器官尤其是雄蕊特异表达启动子的分离、克隆及深入研究，可以指导转基因育种，创造巨大的经济效益和社会效益，更好的为人类的生产生活服务。

但是目前现有的获取启动子的方法都或多或少存在其自身的问题。而且，从目前的现有相关报道来看，现有方式所获得的启动子还不能够很好地满足人们对雄蕊特异表达启动子的需求，尤其是水稻雄蕊特异性表达启动子的需求。因此，科研人员还是希望能够获得更好地分离雄蕊启动子的方法，也希望得到更好地雄蕊启动子。

发明内容

基于目前人们对启动子的研究现状，本发明的目的是提供一种获取植物雄蕊表达启动子STA3的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

步骤(1)制备正向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No:2所示；

步骤(2)制备反向引物，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示；

步骤(3)以水稻品种日本晴的DNA序列为模板，利用所述正向引物和所述反向引物，采用KOD-plus高保真DNA聚合酶对日本晴的DNA序列中的一目的片段进行PCR扩增，该目的片段的核苷酸序列如SEQ ID No:1所示；

步骤(4)对所述目的片段进行加A并连接PGEM-T-Easy载体；

步骤(5)，利用该载体转化大肠杆菌XL-Blue感受态细胞，使感受态细胞激活，进而将目的片段转入到激活的感受态细胞中；

步骤(6)挑取单克隆摇菌液提质粒，用所述正向引物和所述反向引物进行双酶切验证，将经过鉴定的阳性克隆进行测序，验证正确的克隆即为所要获得的目的片段——启动子STA3，其核酸序列如SEQ ID No:1所示；