[发明专利]基于金纳米团簇探针的过氧化氢酶荧光测定方法

权利要求书

1.一种基于金纳米团簇探针的过氧化氢酶荧光测定方法，其特征是利用Fe²⁺催化H₂O₂产生羟自由基使金纳米团簇的荧光发生猝灭，而过氧化氢酶能催化H₂O₂分解生成H₂O和O₂，抑制金纳米团簇荧光的猝灭，从而表现出荧光发射光谱特征的变化，能用于过氧化氢酶的检测。

2.根据权利要求1所述的基于金纳米团簇探针的过氧化氢酶荧光测定方法，其特征是所使用的N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇采用N-乙酰-L-半胱氨酸还原氯金酸的方法制备：将浓度为0.02~0.18 mol/L 的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液和浓度为0.1~0.8 mol/L的氢氧化钠溶液加入到浓度为0.01~0.1 g/L的氯金酸溶液中，混匀，置于20~70°C水浴恒温反应0~3.5小时，反应结束后用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行透析纯化处理，得到N-乙酰-L-半胱氨酸-金纳米团簇荧光材料水溶液。

3.根据权利要求1或2所述的基于金纳米团簇探针的过氧化氢酶荧光测定方法，其特征是所使用的N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇优选采用N-乙酰-L-半胱氨酸还原氯金酸的方法制备：将浓度为0.08 mol/L 的N-乙酰-L-半胱氨酸溶液和浓度为0.5 mol/L的氢氧化钠溶液加入到浓度为0.02 g/L的氯金酸溶液中，混匀，置于37°C水浴恒温反应2.5小时，反应结束后用截留分子量为3500的透析袋对反应液进行透析纯化处理，得到N-乙酰-L-半胱氨酸-金纳米团簇荧光材料水溶液。

4.根据权利要求1或2所述的基于金纳米团簇探针的过氧化氢酶荧光测定方法，其特征是利用N-乙酰-L-半胱氨酸保护的金纳米团簇在650 nm处的荧光强度值（F₆₅₀）以判断过氧化氢酶含量，所使用的激发波长为355 nm。

5.一种基于金纳米团簇探针的过氧化氢酶荧光测定方法，包括如下步骤：1）将含不同浓度的过氧化氢酶溶液，所述过氧化氢酶溶液中含有浓度为20 mmol/L、pH=7.4的HEPES，加入过氧化氢溶液中，所述过氧化氢溶液中含有浓度为20 mmol/L、pH=7.4的HEPES，然后置于25°C温浴反应15~150分钟；2）将含有浓度为40 mmol/L硫酸的Fe²⁺溶液与金纳米团簇溶液依次加入步骤1）的反应液中，摇匀后置于25°C水浴锅反应1~15分钟，反应结束后，测定在650 nm处的荧光强度值（F₆₅₀），随着过氧化氢酶浓度的增大，F₆₅₀逐渐增大，在0.01~0.3 U/mL范围内荧光强度变化值ΔF₆₅₀与过氧化氢酶浓度呈线性关系，检测限为0.002 U/mL。

6.根据权利要求5所述的基于金纳米团簇探针的过氧化氢酶荧光测定方法，其特征是步骤1）所使用的过氧化氢溶液的浓度为10 μmol/L，反应时间为90分钟；步骤2）所使用的Fe²⁺溶液的终浓度为100 μmol/L，反应时间为10分钟。

7.根据权利要求5或6所述的基于金纳米团簇探针的过氧化氢酶荧光测定方法，其特征是过氧化氢酶溶液，过氧化氢溶液，Fe²⁺溶液，金纳米团簇溶液按体积比1：7：2：8混合，反应总体积为0.45 mL。

8.一种基于金纳米团簇探针测定人唾液中过氧化氢酶的方法，其特征是包括如下步骤：1）取新鲜人唾液，经6000转/分钟离心10分钟后，用pH=7.4的缓冲液稀释，取0.025 mL稀释液加入到0.175毫升浓度为10 μmol/L的H₂O₂溶液中，置于25°C反应90分钟；2）将0.05毫升浓度为0.9 mmol/L的含有40 mmol/L硫酸的Fe²⁺溶液与0.2毫升金纳米团簇溶液依次加入上述步骤1）的反应液中，摇匀后置于25°C水浴锅反应10分钟，测定荧光强度值F₆₅₀，通过标准曲线进行定量，获得唾液中的过氧化氢酶含量。