[发明专利]一个水稻锌指蛋白基因的抗白叶枯病基因工程应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种锌指蛋白基因ZFP181过量表达转基因水稻的培育方法，在培育方法中使用的重组载体和转化细胞、转基因水稻的鉴定方法及以上载体、转化细胞、培育方法在水稻抗白叶枯病上的应用。

背景技术

A20/AN1锌指蛋白是一类具有A20或AN1锌指结构的蛋白，其广泛存在于真核生物中。已有研究结果表明，A20/AN1锌指蛋白在动物体中主要参与NF-κB介导的免疫反应，而在植物体中主要参与非生物胁迫响应。

OSISAP1为植物中分离的第一个A20/AN1锌指蛋白基因。OSISAP1的表达受冷、脱水、盐、水浸没(低氧)、重金属、机械伤害等胁迫及胁迫激素ABA的诱导。过量表达OSISAP1可提高转基因烟草幼苗对盐、冷及干旱的耐受性(Mukhopadhyay et al.，2004)。随着基因组测序的深入开展，人们在水稻、拟南芥、杨树、玉米和番茄基因组中分别鉴定了18、14、19、11和13个A20/AN1型锌指蛋白(Huang et al.，2008；Jin et al.，2007；Solanke et al.，2009；Vij and Tyagi，2006)。进一步分析研究发现植物中大部分A20/AN1家族锌指蛋白基因的表达受一种或多种非生物胁迫诱导(Huang et al.，2008；Jin et al.，2007；Solanke et al.，2009；Stroher et al.，2009；Vij and Tyagi，2006)，可能参与了非生物胁迫响应(Solanke et al.，2009；Vij and Tyagi，2006)

随着植物A20/AN1锌指蛋白家族基因的鉴定，关于该基因家族成员功能的鉴定也逐步展开。OsiSAP8受盐、干旱、脱水、冷、水浸没、伤害、重金属及ABA诱导。过量表达OsiSAP8能提高苗期烟草及水稻对盐，冷及干旱胁迫的耐受性。水稻ZFP177受冷及热胁迫诱导，过量表达ZFP177能提高转基因烟草幼苗对冷、热及氧化胁迫的耐受性，但导致转基因烟草幼苗对盐及干旱胁迫敏感。獐毛AlSAP受盐、冷、热胁迫及ABA、SA诱导，异源表达AlSAP能提高转基因酵母对渗透胁迫及离子胁迫的耐受性。过量表达AlSAP转基因烟草与野生型一样表现正常生长表型，同时能提高转基因烟草植株对冷、热、干旱及盐胁迫的耐受性。过量AlSAP转基因水稻表现与其转基因烟草相似结果，能提高其对冷、干旱及盐胁迫的耐受性。此外，AlSAP能提高转基因小麦的抗旱性及耐盐性(Ben Saad et al.，2012a)。AtSAP12受冷及盐诱导，其重组蛋白四级结构随着氧化还原状态改变而改变，高浓度DTT和硫氧还蛋白TrxA，低浓度DTT，硫氧还蛋白与其依赖的NADPH均能降低氧化的AtSAP12聚合体，增加AtSAP12单体蛋白量。在盐及冷胁迫条件下，AtSAP12单体蛋白量显著降低，推测AtSAP12可能通过不同氧化还原状态下功能的改变而来参与非生物胁迫响应(Stroher et al.，2009)。AtSAP10表达受各种胁迫调节，包括金属及非金属离子(Cd、Zn、AsIII、AsIV，Ni和Mn)、ABA、热，盐和冷。AtSAP10能提高转基因拟南芥对高温、Zn、Mn和Ni胁迫耐受性(Dixit and Dhankher，2011)。

以上研究表明A20/AN1型锌指蛋白在植物抗逆应答反应中发挥了重要的作用，然而该类基因在植物抗病应答反应中的研究还罕见报道。

发明内容

针对目前A20/AN1型锌指蛋白类基因在植物抗病应答反应中研究的空白，公开水稻A20/AN1锌指蛋白基因ZFP181在抗白叶枯病基因工程中的应用，过量表达该基因可以提高植物的抗白叶枯病性，有利于水稻抗病性遗传改良。

本发明的目的具体通过以下技术手段获得：

1.本发明提供一种重组载体，该载体包括序列如SEQ ID NO.1所示的A20/AN1锌指蛋白基因ZFP181，通过DNA链接酶将基因ZFP181连接到载体，能够过量表达A20/AN1锌指蛋白。

所述表达载体可使用Ti质粒，Ri质粒，植物病毒载体等，该表达载体以任何一种启动子启动表达，例如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、Ubiquitin启动子、Actin启动子，自身基因启动子或其它启动子，该表达载体中必要时可包括增强子，不论是转录增强子或翻译增强子。

2.本发明还提供包括上述1重组载体的转化细胞。