[发明专利]磁响应性复合脂肪酶的制备方法及生物柴油合成中的应用

权利要求书

1.一种磁响应性复合脂肪酶的制备方法，其特征是包括步骤：

（1）磁响应性脂肪酶液A的制备：以单分散水溶性纳米磁性纳米四氧化三铁颗粒为修饰剂，对具有1，3位置专一性的脂肪酶A进行修饰，并用pH 8.0的磷酸盐缓冲溶液分别配制成酶活力浓度为5-25U/mL的磁响应性脂肪酶液A；

（2）用pH 8.0的磷酸盐缓冲溶液配制5-20U/mL的无位置专一性的脂肪酶液B；

（3）按磁响应性脂肪酶A与脂肪液B的体积比为(0.5-10)：1的比例配制脂肪酶混合液；

（4）用pH 8.0-10.0的磷酸盐缓冲液配制质量分数为3-6%的海藻酸钠溶液；

（5）按体积比为2：1的比例将脂肪酶混合液加入到海藻酸钠溶液中，搅拌0.5-2 h，配置成海藻酸钠混合溶液； 

（6）吸取上述海藻酸钠混合溶液逐滴滴入质量分数1-5%的CaCl₂溶液中，形成直径为2-3 mm的微胶囊球，滤出凝胶小球，更换质量分数1-5% CaCl₂溶液硬化3-5 h后加入质量分数1%戊二醛溶液，置于4℃环境固定化3-12 h；将微胶囊滤出，分别用蒸馏水、磷酸盐缓冲液过滤洗涤几次后，置于4℃冰箱保存备用。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：具有1，3位置专一性的脂肪酶A为疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶Lipase from Thermomyces lanuginosus, TLL；或荧光假单胞菌脂肪酶Lipase from Pseudomonas fluorescens，PFL。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：无位置专一性的脂肪酶B为扩展青霉脂肪酶Lipase from Penicillium expansum，PEL。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：脂肪酶A和脂肪酶B的酶活配比为（2-10）：1。

5.一种利用具有磁响应性复合脂肪酶制备生物柴油的方法，其特征在于：在反应容器中，加入短链醇、油脂和具有磁响应性复合脂肪酶，反应温度为30-50℃，反应48-72 h，制得生物柴油；其中，短链醇与油脂摩尔比为（3-5）：1，磁响应性复合脂肪酶用量为5-25 U/g 油脂；在生物柴油合成过程中，利用复合酶体系的磁响应性，用磁力搅拌代替机械搅拌。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述的油脂为植物油脂。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述的植物油脂是大豆油、菜籽油、花生油和玉米油中的一种或几种的组合。

8.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述的短链醇是甲醇、乙醇、正丙醇或异丙醇。

9.根据权利要求1 所述的制备生物柴油的方法，其特征在于：所述短链醇的加入方式为二步或三步。