[发明专利]一种固定化酶的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及纳米纤维膜的制备领域，具体涉及一种固定化酶的制备方法。

背景技术

酶是一种重要的生物催化剂，具有催化效率高、专一性强、反应条件温和等特点。在食品、酿造、医药等领域具有广泛应用。由于酶的特殊性质，其高级结构对环境十分敏感，如对温度、pH、有机溶剂、重金属离子等因素，且反应后不能够回收，使酶在工业应用中受到限制。

而固定化酶技术可以有效提高酶在极端条件下的稳定性和催化活性，同时易于回收再利用。目前，制备固定化酶的材料和方法有很多种，其中纳米材料固定化酶因其高载酶量受到了研究者的亲睐，尤其是一些具有多孔结构、大比表面积的载体材料有利于提高固定化酶的载酶量，并有利于底物向酶活性中心和产物向反应区域以外扩散和回收的难题。近年来，利用静电纺丝制备纳米纤维膜固定化酶成为一个新兴研究热点。

载体的良好生物相容性是酶固定化载体的必备条件之一。由于良好的生物相容性可以减少酶蛋白与载体间的非特异性相互作用，为固定化酶提供生物友好的微环境，从而提高固定化酶的催化效率。天然高分子材料无毒害，亲水性好，具有适合酶催化反应的天然微环境，是目前固定化酶的首选材料。通常涂覆、吸附、自组装、表面修饰来改善载体的生物相容性。

角蛋白是一种不溶性的纤维状动物蛋白，广泛存在于动物皮肤及皮肤附属物中，如毛发、蹄、壳、爪、角、鳞片等。且角蛋白资源丰富、廉价易得。近几年大量研究表明，角蛋白是一种生物相容性好且不被机体免疫排斥的优质生物医用材料。

专利CN103993425一种聚己内酯-角蛋白复合纳米纤维膜的制备方法，公开日期2014年8月20日，公开了通过静电纺丝技术制备了聚己内酯-角蛋白复合纳米纤维膜，为医用敷料开发提供一种途径。Huang等人利用胶原蛋白等生物大分子对聚(丙烯腈-丙烯酸)纳米纤维膜进行表面改性，并固定化脂肪酶(Huang XJ,Yu AG,Jiang J,Pan C,Qian JW,Xu ZK,J.Mol.Catal.B:Enzym.2009,57:250-256)。

但是，上述技术在改善载体生物相容性和固定化酶存在工艺比较繁琐、很难大规模生产和应用等缺点。

因此，有必要研制一种工艺简单、生物相容性良好、有工业生产潜力的纳米纤维膜，同时提高固定化酶的载酶量、催化稳定性和重复使用性。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种固定化酶的制备方法，以角蛋白与聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)复合纳米纤维膜为载体，制备得到的固定化酶有高的载酶量，催化稳定性好，重复使用性好。

本发明提供的一种固定化酶的制备方法，包括以下步骤：

(1)、将角蛋白与聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)溶解在N,N-二甲基甲酰胺中，完全溶解后，获得纺丝液，注入静电纺丝装置中进行静电纺丝，将获得的复合纳米纤维膜置于真空干燥箱中在25℃～40℃条件下干燥5～10h，即得到角蛋白与聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)复合纳米纤维膜；

(2)、将角蛋白与聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)复合纳米纤维膜浸入质量分数为3％～6％的戊二醛溶液中，25℃水浴震荡1～4h，震荡速度40～100r/min，取出后用蒸馏水冲洗，再浸入1～15mg/ml的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚铵盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺的磷酸盐缓冲液中震荡活化1～4h，震荡速度40～100r/min；取出后在pH为7的磷酸盐缓冲液反复冲洗，得到活化后的角蛋白与聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)复合纳米纤维膜；

(3)、将活化后的角蛋白与聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)复合纳米纤维膜浸入浓度为0.4～1.0mg/ml酶的磷酸盐缓冲液中，密闭后在4～25℃的恒温条件下震荡1～4h，震荡速度为40～100r/min，取出，用磷酸盐缓冲液反复冲洗5次，即可得到角蛋白与聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)复合纳米纤维膜固定化酶。

步骤(1)中所述角蛋白与聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)的质量比为1:4-19；所述聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)的丙烯酸甲酯与丙烯酸质量比为4-19:1。

步骤(1)中所述纺丝液中角蛋白与聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)的总质量分数为26％～30％；静电纺丝的条件控制为：电压为14～20kV，纺丝流速为0.2～0.6ml/h、接受距离为10～25cm。

步骤(1)中所制备得到的角蛋白与聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸)复合纳米纤维膜的直径为300～600nm。