[发明专利]表达鸡IL2重组新城疫病毒及其在疫苗中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种表达鸡IL2重组新城疫病毒及其在制备鸡新城疫病疫苗中的应用。

背景技术

新城疫病毒（Newcastle Disease Virus，NDV）是危害养禽界的烈性传染病之一，已被国际兽疫局（The Office International des Epizooties, OIE）列定为A类传染疾病。如今，虽然没有发生世界性的大流行，但局部地区的疫情时有发生，给养禽界带来巨大经济损失，我国每年用于防治新城疫病（Newcastle Disease，ND）的疫苗达到上亿元。目前，灭活疫苗和弱毒疫苗在ND免疫预防中最为常用。

白细胞介素2(Interleukin 2，IL2)主要是由T淋巴细胞或T淋巴细胞系产生的一类重要的淋巴因子，在抗肿瘤、抗毒素、免疫调节及感染性疾病的治疗中具有重要作用。

对哺乳动物的IL2在B、T细胞的增殖和分化，增强NK细胞、单核细胞杀伤活性等功能中发挥着重要的作用，甚至可对神经系统发挥免疫调节作用。鸡的IL2作为第一个克隆的非哺乳动物的IL2，又与哺乳动物的IL2分子有明显的不同。

除了T细胞外，IL2对免疫系统的其它细胞都有直接或间接的影响。在间接的方面，IL2分别刺激IFNα、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和B细胞生长因子(即调节巨噬细胞及B细胞活性的细胞因子)的产生，所以rChL2的产生为我们研究禽免疫学提供了一个有用的工具，同样也可作为一种潜在疫苗增强剂。

发明内容

本发明的目的是提供一种表达鸡IL2重组新城疫病毒及其在制备鸡新城疫病疫苗中的应用。

本发明提供的鸡新城疫病毒毒株（命名为rClone30-chIL2病毒），其制备方法包括如下步骤：将重组质粒pBrClone30-chIL2、pBL-N质粒、pBL-P质粒和pBL-L质粒共转染哺乳动物细胞并培养，得到所述鸡新城疫病毒毒株；所述重组质粒pBrClone30-chIL2为具有序列表的序列1所示的DNA分子的质粒。序列表的序列3即为rClone30-chIL2病毒的基因组DNA。

所述重组质粒rClone30-chIL2具体可为序列表的序列3所示的质粒。

所述哺乳动物细胞具体可为BHK-21细胞。

rClone30-chIL2病毒的制备方法具体如下：

（1）将所述重组质粒pBrClone30-chIL2、pBL-N质粒、pBL-P质粒和pBL-L质粒共转染BHK-21细胞（每1×106个细胞转染1μg重组质粒pBrClone30-chIL2、0.5μg pBL-N质粒、0.25μgpBL-P 质粒和0.1μgpBL-L质粒），置于5% CO2、37℃环境中静置培养72h；

（2）取步骤（1）得到的转染细胞，反复冻融3次，离心收取细胞上清液，然后接种于9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔，置于37℃环境中培养72h，收集鸡胚尿囊液；

（3）取步骤（2）得到的鸡胚尿囊液，接种于新的9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔，置于37℃环境中培养72h，收集鸡胚尿囊液；

（4）取步骤（3）得到的鸡胚尿囊液，接种于新的9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔，置于37℃环境中培养72h，收集鸡胚尿囊液；

（5）将步骤（2）得到的鸡胚尿囊液、步骤（3）得到的鸡胚尿囊液和步骤（4）得到的鸡胚尿囊液混合，得到混合液，即为rClone30-chIL2病毒液。

本发明还保护一种鸡新城疫病毒毒株（命名为rClone30-chIL2病毒），其基因组DNA如序列表的序列3所示。

本发明还保护以上任一所述的鸡新城疫病毒毒株在制备鸡新城疫病疫苗中的应用。

本发明还保护一种鸡新城疫病疫苗，包括以上任一所述的鸡新城疫病毒毒株。

本发明提供一种新的鸡新城疫病毒毒株，命名为rClone30-chIL2，因此简称毒株rClone30-chIL2。毒株rClone30-chIL2是将chIL2多肽的编码基因插入到鸡新城疫病毒毒株Clone30（简称毒株Clone30，弱毒株，为现有的新城疫病活疫苗）的基因组的F基因和HN基因之间得到的重组病毒株。毒株rClone30-chIL2免疫鸡群后，7 d后攻毒，重组病毒具有较好的保护效果，为进一步提高NDV重组新城疫疫苗的早期免疫效果提供了新思路。

本发明构建的重组新城疫病毒可视为基因工程改造后的弱毒疫苗株，可制备为任何常规制剂，如冻干粉针制剂、液体疫苗制剂等。