[发明专利]特定发育阶段血吸虫miRNA关键靶基因的分析与鉴定方法

权利要求书

1.一种特定发育阶段血吸虫miRNA关键靶基因的分析与鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)分析特定发育阶段血吸虫的特征性miRNA表达：

通过Solexa分析，比较日本血吸虫不同发育时期miRNA表达特点，从中确定特定发育阶段血吸虫的特征性miRNA；

(2)特定发育阶段血吸虫的基因表达谱分析：

通过Solexa分析并比较特定发育阶段血吸虫的基因表达谱，从中找到高表达的基因和低表达的基因，即差异表达基因群；

(3)特定发育阶段血吸虫的特征性miRNA关键基因的分析：

通过生物信息学预测该miRNA在本物种内所有靶基因，并与特定发育阶段差异表达的基因群取交集，获得两群中共有基因，分析其中参与关键代谢通路的基因，将之定为特定发育阶段血吸虫特征性miRNA的“候选关键靶基因”，简称关键基因；

(4)确定关键基因中的靶基因：

利用该miRNA类似物进行体外实验，以筛选出关键基因中的靶基因；

利用生物信息学分析关键基因3’UTR区的miRNA结合位点；

结合Luciferase荧光素酶报告系统进一步确认该miRNA与该基因3’UTR区调控关系。

2.根据权利要求1所述的一种特定发育阶段血吸虫miRNA关键靶基因的分析与鉴定方法，其特征在于，步骤(3)所述的特定发育阶段血吸虫的特征性miRNA关键靶基因的分析包括以下步骤：

(a)利用生物信息学分析，在血吸虫全基因组中预测出步骤(2)得到差异表达基因，将该基因群与步骤(3)中预测靶基因群取交集，得交集基因群；

(b)基于差异表达基因谱，通过生物信息进行pathway分析，将虫体发育中处于关键代谢通路中的基因群与步骤(a)所得交集基因群取二次交集，初步确定该交集基因群中参与关键代谢过程的基因为关键基因。

3.根据权利要求1所述的一种特定发育阶段血吸虫miRNA关键靶基因的分析与鉴定方法，其特征在于，步骤(4)中，用miRNA类似物进行体外实验，以筛选出关键基因中的真正靶基因，具体包括以下步骤：

(a)血吸虫尾蚴感染小鼠到特定发育阶段后用无菌预冷生理盐水从小鼠主动脉灌注，冲出血吸虫，并用含抗生素的无菌生理盐水冲洗2次；

(b)用注射器针头挑取血吸虫虫体，转移到16孔板；每孔雌雄虫10对，至少4孔；一孔一组，分A、B、C和D四组；

(c)在RPMI-1640培养基，37℃，5％CO₂培养；每组补加下列成分：A组：5OD of inhibitor N.C.；B组5OD of miRNA类似物，C组：5 OD ofmiRNA inhibitor；D组：5OD of Negative control；

(d)每天换液，并补充相应成分，连续5天；

(e)挑取雌虫，转入无菌平皿上的三个ddH₂O水泡中依次浸泡，水泡每次更新，然后再转移到含有1000ul Trizol试剂的EPP管中，-80℃保存备用，或者直接匀浆取RNA；

(f)利用Real time PCR方法检测各组虫中关键基因表达特征，按如下原则：B基因表达下调，C组基因表达上调，提示该基因为miRNA潜在靶基因，反之不是。

4.根据权利要求1所述的一种特定发育阶段血吸虫miRNA关键靶基因的分析与鉴定方法，其特征在于，步骤(4)中，利用生物信息学分析上述选择的关键基因及其3’UTR区的miRNA结合位点，具体通过以下步骤进行：

1)确定miRNA与靶基因接合区域：

通过聚类分析，比较多物种相同miRNA的序列保守区；

2)分析关键基因及其上下游miRNA接合区域：

通过将miRNA保守区段与关键基因比较，若找到结合区，则可进一步判定为潜在靶基因，并做进一步Luciferase荧光素酶报告系统的分析。

5.根据权利要求1所述的一种特定发育阶段血吸虫miRNA关键靶基因的分析与鉴定方法，其特征在于，步骤(4)中，结合Luciferase荧光素酶报告系统进一步确认该miRNA与该基因3’UTR区调控关系，具体通过以下步骤进行：

1)LUC-靶基因3’UTR报告质粒构建；

将选定关键基因，3’UTR区序列导入目的基因：

2)目的miRNA过表达质粒构建：

基于目的miRNA成熟序列设计引物，引物含交换配对碱基、酶切位点，并含有目的基因5’端部分序列用于PCR钓取目的基因；

通过该引物扩增血吸虫基因组，获得目的miRNA基因序列，并将该序列导入载体GV268，元件顺序为CMV-MCS-SV40-Neomycin；

3)质粒转染后luciferase检测：

使用293T细胞和“Dual-Glo^TMLuciferase Assay System (E2920，promega)”试剂盒进行luciferase表达检测。