[发明专利]一种采用大豆过氧化氢酶标记的生物芯片及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种采用大豆过氧化氢酶标记的生物芯片及其制备方法。 

背景技术

生物芯片是生命科学领域中迅速发展起来的一项高新技术，主要是指通过微加工技术和微电子技术在固体芯片表面构建的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、DNA以及其他生物组分的准确、快速、高通量的检测，它具有体积小、试剂和能量消耗少、样品分析速度快、通量高等优点。可以利用生物芯片高通量的优点，实现对多种血清学标志物的同时筛查，将生物芯片技术应用于产前筛查领域，突破了临床筛查唐氏综合症单次只能测定一项指标的界限。在产前血清学筛查中，利用生命分析化学新技术，结合纳米科学、临床医学等领域的新技术新方法，发展产前筛查标志物临床检验新技术，开发唐氏综合征产前筛查标志物临床检测芯片，分析检测结果与常用检测方法的差异和相关性，评价各项检测指标对胎儿出生缺陷的评估价值，对于降低产前筛查检测费用、提高群体的筛查普及率，具有重要的意义。 

大豆过氧化氢酶（Soybean peroxidase, SBP）是一类具有很高活性的酸性同功酶，是从大豆皮中提取出来的，提取原料来源充足、价廉易得。具有耐热性能高，底物作用范围广，酸碱稳定性好，pH适用范围宽等优点。辣根过氧化氢酶（Horseradish peroxidase，HRP）是一个阳离子酶，当用它来催化鲁米诺-过氧化氢反应时，即使是在发光体系中加入了对碘苯酚后，仅仅是在开始的几分钟化学发光强度明显增强，并且达到峰值，后来因HRP与底物氧化自由基产物相互作用而使酶的失活，导致化学发光强度迅速衰减。而作为阴离子的SBP，其不会因为氧化反应产物作用失活，发光信号的衰退没有HRP迅速，即会产生一个较长时间的化学发光信号，使用该种酶代替常用的辣根过氧化氢酶作为标记酶用于生物芯片系统检测，具有更高的稳定性。 

发明内容

本发明所解决的技术问题是： 

提供一种大豆过氧化氢酶标记的生物芯片，采用大豆过氧化物酶为标记酶，解决了现有技术中HRP催化致使鲁米诺氧化反应产生的化学发光信号不稳定的问题。本发明所提供了酶标记生物芯片可以同时检测多种蛋白。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是： 

提供一种采用大豆过氧化氢酶标记的生物芯片，该生物芯片包括捕获单克隆抗体包被的硝酸纤维素膜、生物素标记多克隆抗体、大豆过氧化氢酶标记的链酶亲和素以及大豆过氧化氢酶所作用的发光底物液，其中，捕获单克隆抗体和生物素标记多克隆抗体均可以同待测抗原特异性结合。 

所述的一种采用大豆过氧化氢酶标记的生物芯片中的捕获单克隆抗体可以是针对不同待测抗原的多种捕获单克隆抗体；上述生物芯片中所用的发光底物液可以是1.2 mM 3-（10′-吩噻嗪基）丙基-1-磺酸盐、0.6 mM 4-马琳吡啶、0.4 mM 鲁米诺、0.4 mM H2O2以及50 mM pH 8.5的Tris-HCl缓冲液组成的混合溶液。 

优选的，一种采用大豆过氧化氢酶标记的生物芯片，其中，硝酸纤维素膜由甲胎蛋白（AFP）、人绒毛膜促性腺激素β亚基（β-HCG）、游离雌三醇（uE3）、抑制素A(InhibinA)四种蛋白抗原所对应的捕获单克隆抗体包被，生物素标记多克隆抗体为生物素标记的AFP多克隆抗体、β-HCG多克隆抗体 、 uE3多克隆抗体、InhibinA多克隆抗体，该生物芯片用于检测孕中期唐氏综合症筛查中的四项血清学标志物。 

一种采用大豆过氧化氢酶标记的生物芯片的制备方法，包括以下步骤: 

a.采用大豆过氧化氢酶标记链酶亲和素；

b.使用捕获抗体包被硝酸纤维素膜；

c.封闭硝酸纤维素膜上的非特异性活性位点；

d.生物素标记可与待测抗原特异性结合的多克隆抗体；

e.配制大豆过氧化氢酶所作用的发光底物液。

上述制备大豆过氧化氢酶标记链酶亲和素的步骤a采用改良过碘酸钠法制备，其具体步骤如下： 

步骤一、取1 mg 大豆过氧化氢酶溶于100 μL PBS中，加入12 mg/mL NaIO₄溶液100 μL，混匀，置室温避光反应15 min；

步骤二、 取出步骤一得到的溶液，后加入100μL, 1%乙二醇室温反应30min；

步骤三、向步骤二得到的溶液中加入100ul, 5mg/ml 链酶亲和素，混匀，装入透析袋，于50 mM pH 9.6碳酸盐缓冲液4℃透析24 h，使大豆过氧化氢酶和链酶亲和素结合；