[发明专利]一种鸡传染性支气管炎病毒的基因工程亚单位疫苗及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，尤其涉及一种鸡传染性支气管炎亚单位疫苗及其制备方法。

背景技术

传染性支气管炎(IB)是鸡的一种急性、高度接触传染性疾病，由传染性支气管炎病毒(IBV)引起。该病主要侵害鸡的呼吸系统、泌尿系统和消化系统，表现出广泛的组织嗜性和高度的遗传变异性，可导致不同日龄、性别和品种的鸡只发生不同程度的疾病，死亡率较高，有报道腺胃型IB导致的雏鸡死亡率可达95％。除此外，IBV还可侵害肾脏、生殖道、肠道、肌肉等，引起鸡的增重和饲料报酬率降低，产蛋鸡的产蛋量及产蛋品质下降，给养鸡生产带来巨大的损失。该病广泛流行于世界各地，是严重危害世界养禽业的重大传染病之一。

目前，疫苗免疫是对IB防控最有效的手段，其中最常用的是灭活疫苗和减毒活疫苗，另外还有现在比较热门的基因工程疫苗，然而使用的效果一直不够理想。由于IB血清型众多，各血清型之间仅有部分或完全没有交叉保护作用，从而给本病防治带来很大困难，该病的爆发时有发生。现有传染性支气管炎灭活疫苗的免疫效果不理想，对同血清型的毒株的攻毒保护率很少超过50％，主要原因是现有灭活疫苗不能诱导足够高的抗体，因此急需开发安全有效的新型IB疫苗。

发明内容

有鉴于此，有必要针对上述问题，提供一种高效的鸡传染性支气管炎病毒疫苗及其制备方法，尤其是一种鸡传染性支气管炎病毒的基因工程亚单位疫苗及其制备方法。本发明鸡传染性支气管炎病毒S1与H3N2流感病毒HA2融合基因工程亚单位灭活疫苗，该疫苗对鸡传染性支气管炎病具有良好的预防和控制效果。

为了实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

一种鸡传染性支气管炎病毒的基因工程亚单位疫苗的制备方法，包括以下步骤：

S1：分别扩增传染性支气管炎病毒H120毒株S1基因和H3N2流感病毒HA2基因；

S2：通过overlapping方法构建S1基因和不同长度的HA2基因的嵌合基因S1/HA2；

S3：将嵌合基因S1/HA2插入pFastBac^TM1载体中，得到重组载体；将重组载体转化DH10Bac感受态细胞获得重组杆状病毒穿梭载体；

S4：利用昆虫杆状病毒表达系统得到重组杆状病毒并表达重组蛋白；

S5：灭活重组杆状病毒和制备油乳化疫苗。

优选地，所述步骤S1包括以下步骤：

S11：抽提传染性支气管炎病毒H120毒株全基因组RNA，将所抽提的全基因组RNA反转录为cDNA及PCR扩增S1基因；

S12：合成H3N2流感病毒HA基因，PCR扩增HA2基因。

优选地，所述步骤S2包括以下步骤：

S21：以S1基因PCR产物为模板扩增得到片段S1；

S22：以HA2基因PCR产物为模板扩增得到不同长度的片段HA2；

S23：以片段S1和不同长度的HA2为模板，以引物S1-F，引物HA2-R为引物，进行Overlapping PCR扩增得到嵌合基因S1/HA2。

优选地，所述步骤S3包括以下步骤：

S31：用SalI和HindIII在37℃分别消化质粒pFastBac^TM1和嵌合基因的PCR产物，在T4连接酶的作用之下，连接各个已消化基因的PCR产物和质粒；

S32：用连接产物转化大肠杆菌DH5α，经Ampr抗性筛选，获得插入了不同基因的转化子，对含有转化子的单克隆菌液进行PCR筛选、测序；

S33：将测序正确的重组质粒转化DH10Bac感受态细胞，通过蓝白斑筛选和PCR鉴定获得重组杆状病毒穿梭载体rBacmid。

优选地，所述步骤S5包括以下步骤：

S51：灭活重组杆状病毒，灭活剂最终体积浓度为0.1％，37℃灭活16-24小时；

S52：制备油乳化疫苗。

优选地，本发明鸡传染性支气管炎病毒的基因工程亚单位疫苗的制备方法中使用的表达系统为昆虫杆状病毒表达系统。

本发明还提供一种通过上述方法制备的疫苗。优选地，所示疫苗的序列如SEQ ID NO：3-5所示。