[发明专利]测定水痘-带状疱疹病毒中和抗体的试剂盒及生产方法

权利要求书

1.一种测定水痘-带状疱疹病毒中和抗体的试剂盒，采用感染VZV的细胞作为抗原，包被固定在96孔板的孔内，使用细胞表面携带的大量病毒糖蛋白来捕获待测样品中的中和抗体，同时保持细胞完整，内部的其他病毒抗原并不与样品接触，从而能保证测定中和抗体的特异性。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于， 其组成为：

96孔板：感染了VZV的人胚肺成纤维细胞均匀包被在每个孔内；

样本稀释液，也称为试剂R1；20mmol/L磷酸盐、叠氮钠0.1%、牛血清白蛋白1%；

标准血清，也称为试剂R2：来自水痘愈后患者，其效价经过VZV IgG国际标准品标定的人抗VZV血清，用R1稀释到1IU/ml；

洗涤液，也称为试剂R3：20mmol/L磷酸盐、氯化钠0.9%、吐温-20 0.1%、牛血清白蛋白1%；

酶标二抗，也称为试剂R4：20mmol/L磷酸盐、牛血清白蛋白1%、辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG；

底物，也称为试剂R5：取含2mg/ml 3,3',5,5'-四甲基联苯胺的无水乙醇溶液1.56ml，50mmol/L磷酸氢二钠-25mmol/L枸橼酸缓冲液31.25ml，0.75%过氧化氢溶液0.1ml，混匀；

终止液，也称试剂R6：2mol/L硫酸。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的96孔板的每个孔内均匀包被有感染了VZV的人胚肺成纤维细胞，每孔包被抗原细胞的数量为300-3000个。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，96孔板内各孔包被细胞数目CV＜10%。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，细胞包被后的96孔板在经过3次洗涤和3次37℃恒温振荡处理后，孔内细胞脱落不超过20%。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，细胞包被后的96孔板在经过3次洗涤和3次37℃恒温振荡处理后，孔内细胞脱落不超过10%。

7. 一种测定水痘-带状疱疹病毒中和抗体的试剂盒的制备方法，其操作步骤如下：

（1）在长成致密单层的人胚肺成纤维细胞中接种VZV毒种：接种比例为：每1000个细胞接种50-300个噬斑形成单位PFU的VZV病毒，37℃、5%二氧化碳条件下培养2~5天，细胞病变50-80%，使用0.25%胰酶将细胞消化成单个，并加入人血白蛋白或牛血清白蛋白，控制其终浓度为2%-10%；并将细胞密度控制到能满足步骤（2）的要求；

（2）将步骤（1）中消化下来的细胞充分混匀、悬浮，加入准备好的96孔板中，每孔加细胞悬液5-10微升，控制每孔中细胞数目在300-3000个之间，水平震荡96孔板，使细胞悬液均匀分布在孔底，每孔再加入5-10微升2%-5%的戊二醛溶液，水平震荡96孔板，混匀，室温反应10分钟后孔内溶液凝固，待用；

（3）将（2）步骤中的96孔板浸入封闭液中，保证所有孔中充满封闭液，室温封闭1-2小时，使用R3洗后自然风干；封闭液为含5%脱脂奶粉或1%牛血清白蛋白的PBS溶液；

（4）按照以下方法配置各种试剂：

R1：20mmol/L磷酸盐、叠氮钠0.1%、牛血清白蛋白1%；

R2：人抗VZV血清（来自水痘愈后患者，其效价经过VZV IgG国际标准品标定），用R1稀释到1IU/ml；

R3：20mmol/L磷酸盐、氯化钠0.9%、吐温-20 0.1%、牛血清白蛋白1%；

R4：20mmol/L磷酸盐、牛血清白蛋白1%、辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG；

R5：取含2mg/ml 3,3',5,5'-四甲基联苯胺 （TMB）的无水乙醇溶液1.56ml，50mmol/L磷酸氢二钠-25mmol/L枸橼酸缓冲液31.25ml，0.75%过氧化氢溶液0.1ml，混匀；

R6：2mol/L硫酸。

8.一种测定水痘-带状疱疹病毒中和抗体的试剂盒的使用方法，具体步骤如下：

用R1将待测样本稀释到合适的浓度，同时用R1将R2进行系列倍比稀释，用于制作标准曲线；

将稀释好的待测样本与标准样品分别加入96孔板的孔中，1孔加入R1作为空白对照；

每孔加样100微升，37℃孵育30分钟；

用R3清洗96孔板3次，甩干残余洗涤液；

每孔加入100微升R4，振荡混匀，37℃孵育30分钟；

重复步骤C；

每孔加入100微升R5，振荡混匀，37℃孵育10分钟；

每孔加入100微升R6，振荡混匀，使用酶标仪在405nm读取OD值；

所有样品的OD值扣减空白对照孔的OD值；

根据标准样品的效价和OD值制作标准曲线，将待测样品OD值带入回归方程即可计算出效价。