[发明专利]联合细胞模型及其制备方法和用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种联合细胞模型。

背景技术

据估计，在新药开发中，临床检测发现50％的候选药物药效不理想，40％的候选药物存在安全性问题，导致开发失败，前期开发工作浪费。若能提前对候选药物的活性和毒性进行体外评估，可以极大降低药物开发成本。ADME/Tox模式，药物代谢和毒性检测模式，是近年发展起来的、全新的，是在细胞水平上早期进行吸收、分布、代谢、清除和毒性实验的新型新药研究模式，其可以提前对候选药物的活性和毒性进行体外评估，近年来在国外各大制药企业中得到广泛应用。

对候选药物进行早期筛选时，可以根据研究的需要，选用相应的高通量ADME/Tox体外模型，对药物进行早期的活性/毒性筛选。

Caco-2细胞模型，人结肠腺癌细胞，用于研究药物吸收的细胞模型。孙敏捷等，“Caco-2细胞单层模型的建立与验证”，中国药学杂志2006年9月第41卷第18期公开了一种Caco-2细胞模型的制备方法：将Caco-2细胞模型在T-75培养瓶中培养，培养液为MEM/EBSS NEAA(pH7.4，含胎牛血清10％、L-谷氨酰胺2mmol/L、Hepeps 10mmol/L、青霉素、链霉素)，在37℃，含5％CO₂培养箱中全湿度培养，按1:3比例传代后，将细胞接种在24孔Millicell插入式培养皿中，接种密度为1mL含8×10⁴个，每孔400μL，基底侧加入培养液600μL培养液培养21天，期间换液。

L-02肝细胞模型，用于研究药物代谢的细胞模型。

利用细胞模型研究药物的吸收和代谢过程如果于单个细胞模型的顺序使用，只能分别考察药物的吸收和代谢，浪费时间，同时相较于体内药物代谢研究，缺少肝肠循环这一重要环节，存在较多干扰因素导致检测不准确。

中国专利CN102876633A公开了一种联合细胞模型，它包括Caco-2细胞模型和大鼠原代肝细胞模型。该模型采用大鼠肝细胞模型与Caco-2细胞模型相加，与人体间具有种属差异，且大鼠原代肝细胞培养操作复杂。因此，需要发明一种与人体内环境更加相似的联合细胞模型。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种与人体内环境更加相似的联合细胞模型，它包括Caco-2细胞模型和L-02肝细胞模型，所述Caco-2细胞模型与L-02肝细胞模型以半透膜相隔。

所述半透膜为聚碳酸酯膜、聚酯膜或混合纤维素膜，膜孔径为0.4～8.0μm。

所述聚酯膜为Millicell悬挂式培养皿。

所述的Caco-2细胞模型是细胞跨膜电阻值≥550Ω·cm²的细胞系。所述的Caco-2细胞模型是细胞跨膜电阻值为550～800Ω·cm²的细胞系。

所述联合细胞模型是按照如下方法制备而成：

a、取Caco-2细胞，复苏，加入DMEM-20％培养液中培养，按1:3传代，培养2代后，换成DMEM-10％培养液继续传代培养；

b、取铺有鼠尾胶原的培养皿和步骤a制备的第3～15代中任意一代细胞，调整细胞密度为1.5×10⁵个/mL，从AP侧接种到铺有鼠尾胶原的培养皿上，在培养皿BL侧加入DMEM-10％培养液，置于37℃，含5％CO₂的培养箱中培养，连续培养17～25天，期间更换培养液，得载有Caco-2细胞模型的培养皿；

c、取L-02肝细胞，复苏，加入DMEM-20％培养液中培养，按1:3传代，培养2代后，换成DMEM-10％培养液继续传代培养；

d、取步骤c制备的L-02肝细胞混悬液，调整细胞密度为1.5×10⁵个/ml,接种于铺有鼠尾胶原的细胞培养板上，每孔加入2ml并每天换液，培养1～5天，得载有L-02肝细胞模型的细胞培养板；

e、将步骤b所得载有Caco-2细胞模型的培养皿，置于步骤d所得载有L-02肝细胞模型的细胞培养板之上，即可。

步骤b中，AP侧指顶端，BL指底端。

其中，步骤b中：

铺有鼠尾胶原的培养皿是按照如下方法制备：取Millicell悬挂式培养皿，加入浓度为50μg/ml的Ⅰ型鼠尾胶原，加样量为100μl/cm²，紫外照射1小时，放入37℃，5％CO₂培养箱内过夜，PBS清洗3次，即可；

取第4代细胞；连续培养21天；更换培养液的方式为接种24h后更换培养液，前一周隔天换液，一周后每天换液。