[发明专利]活体细胞玻璃化冷冻/复苏的自动操作方法、系统及载体

说明书

技术领域

本发明主要涉及玻璃化冷冻技术领域，尤其涉及一种活体细胞玻璃化冷冻/复苏的自动操作方法和系统，以及活体细胞玻璃化冷冻/复苏载体。

背景技术

人工辅助生殖技术中，人类生殖力的体外保存一直广受关注。迄今为止，人类精子库正常运营了接近30年时间，受精卵的玻璃化冻融和复苏技术在本世纪早期开始普及，但人类卵母细胞的体外保存受制于操作方法的局限，没有获得实质进展，全球范围内，还没有投入稳定运行和应用的人类卵子库。从生理来源上比较，人类卵子是人类生殖力体外保存的主要对象，精子次之；受精卵的体外保存服务的对象是家庭，体外保存的受精卵，伦理和法律上已经获得了不可更改的属性，是生殖功能的结果，或者说是生殖行为的冻结状态和中间状态。

卵细胞的冻存和复苏技术区别于早期胚胎和精子的冻存复苏，对冻存和复苏的成功率要求更严格，卵细胞本身的生理构成区别于胚胎细胞，目前的方法和设备不足以达到卵细胞标准化冻融和稳定复苏。

目前广泛使用的早期胚胎玻璃化冻融和复苏技术依赖手工操作。冻融过程包括：1、操作员制作玻璃化冷冻的脱水剂和冷冻保护剂液滴组合，准备冷冻载体并标注、登记；2、调整操作环境温度到适宜区间；3、手工吸取需要冷冻的细胞，4、转移细胞到脱水剂液滴，等待细胞脱水到合适的状态，一般这一过程以平均脱水时间来认定是否达到标准；5、快速转移细胞入冷冻保护剂液滴，维持足够长的时间；6、快速转移细胞到冷冻载体，快速吸取细胞周围吸附的液体，使细胞暴露的表面积最大；7、将粘附有细胞的载体快速投入液氮，装管，记录，完成操作。

玻璃化冻融细胞复苏的操作依赖梯度复苏液系统，序列复苏液设计成不同的浓度梯度，包括步骤：1、将液氮环境中的载体取出，快速放置入梯度液体一，识别并确认细胞脱离载体，复温；2、按照设定的时间序列，依次转移细胞到梯度液体二、三、四；3、洗涤并转移细胞到培养液；4、观察并记录细胞状态，完成复苏操作。

卵细胞的玻璃化冷冻和复苏在手工操作的状态下无法达成标准化。由于细胞特异的结构和成分特征，卵细胞不能耐受快速的脱水过程，不能耐受快速脱水所要求的高渗透压差，安全达到休眠状态。手工冷冻卵细胞，必须设计序列脱水与冷冻保护剂液体系统，而且序列液的浓度梯度差需满足卵细胞脱水的生理要求。在手工操作模式下，操作员要快速将细胞在大量的序列液滴中依次转移，或者将梯度液设置成互相临近的液滴，将细胞转移入起始序列液滴后，在规定的时间将起始液滴连通第二序列液滴，液滴之间由于渗透压差，自然单向流动融合，将细胞移动到液滴连通通道，卵细胞自然进入第二液滴，依次操作后，快速转移入液氮环境，完成冷冻。而冻融卵细胞的复苏操作过程是前述冷冻过程的重复，但梯度液体的顺序相反。

操作员将卵细胞在大量序列液滴中快速依次转移，对操作员的技能要求严格，不能避免误操作和操作失误；液滴连通法中，细胞的液体环境不受控，对操作员的技能要求也很严格，操作结果无法标准化，这严重影响了卵细胞冷冻和复苏的临床应用。如果卵细胞冻融复苏的成功率不能接近95％甚至更接近100％，这种操作方法的实用性就会受到质疑，因为卵细胞的来源有限，一个治疗周期后，获得的卵细胞数量不会太多，有些情况下，每次手术只能获得1个可用卵细胞(微刺激方案、自然周期取卵方案等)；如果需要冷冻的卵细胞数量多，连续的重复操作过程对操作员的体能要求会升高，影响操作结果。

因此，需要开发一种活体细胞玻璃化冷冻的自动操作方法及系统。

发明内容

本发明的目的是提供一种活体细胞玻璃化冷冻/复苏的自动操作方法和系统，以及活体细胞玻璃化冷冻/复苏载体，能够自动完成包括但不限于卵细胞、早期胚胎、囊胚等活体细胞的自动玻璃化冷冻和复苏，并提供了标准化的操作过程。

为达到上述目的，本发明的实施例提供了一种活体细胞玻璃化冷冻/复苏载体，所述载体本体为内表面呈弧面的片状结构，所述载体本体的内表面上设有超疏水表面功能区域和亲水表面功能区域，所述亲水表面功能区域四周被所述超疏水表面功能区域环绕，所述亲水表面功能区域上设有液滴定位标识。

作为上述技术方案的改进，所述超疏水表面功能区域为圆环形区域，所述亲水表面功能区域为圆形区域。

作为上述技术方案的改进，所述亲水表面功能区域的中心点与所述载体本体的最低点重合。

作为上述技术方案的改进，所述超疏水表面功能区域为在所述载体的内表面上铺设了一层超疏水材料的超疏水表面层或所述超疏水表面功能区域为将所述载体的内表面的部分区域经过超疏水处理后所得的超疏水表面层。