[发明专利]一种介入溶血栓生物制品单环刺螠纤溶酶的制备工艺

说明书

技术领域：

本发明涉及一种介入溶血栓生物制品单环刺螠纤溶酶的制备工艺，该生物制品，可以用于血栓性疾病的基础研究以及临床应用。

背景技术：

血栓性疾病是因为血栓形成后直接或脱落后完全或部分阻塞血管、造成器官组织缺血坏死，是严重危害人类健康的一种循环系统疾病，已经占据全球疾病总死亡率的第一位，常表现急性心肌梗死、脑梗死、深静脉血栓、肺动脉栓塞。目前，临床上血栓性疾病的主要治疗药物有抗血小板类药物、抗凝血药、溶血栓药物，后者是目前临床应用最广泛的治疗手段。溶血栓药又称为纤维蛋白溶解药，可激活纤溶酶而促进溶解血栓。第一代溶血栓药链激酶(SK)和尿激酶为代表。但其对纤维蛋白特异性差，主要不良反应是引起机体广泛出血，尤其是发生颅内出血的危险性很大，并发生再栓塞，它常常引起发热反应和其它如过敏反应等问题，抗原性强会产生大量的链激酶抗体。尿激酶也具有这些问题。第二代溶血栓药主要指组织型纤溶酶原激活物(如t-PA)等，t-PA又称为阿替普酶，与纤维蛋白有较好的亲和性而具有较强的血栓选择性，全身纤溶作用小，副作用小，然而其半衰期短(3分钟)，需短时间内大量给药，价格昂贵，而且有引起颅内出血的危险性。Sak在溶血栓速率和对纤溶酶原的保护方面均优于t-PA，但它有显著的免疫原性，不能重复使用。目前国际研发力量正在致力于应用蛋白质工程手段开发第三代溶血栓剂(如蚓激酶)等。蚓激酶是从特种蚯蚓中提取或分子重组的一类物质，兼有激酶和纤溶酶两种作用，对多种血栓疾病有较好的疗效，如治疗冠心病心绞痛、急性脑梗死、突发性耳聋、肾病综合征等多种疾病，但大多蚓激酶产品是非单一组分，并存在过敏等副作用。其他的第三代溶血栓药(瑞替普酶、降纤酶等)仍然存在着体内半衰期短、稳定性差、特异性和安全性有待进一步提高等问题。另外，这三代药物的共同问题是不能完全溶解新鲜和陈旧性血栓，即使介入溶栓也无法完全溶解血栓。因此，研发出血栓靶向性强而不易引起颅内出血等全身出血并发症、能够完全溶解血栓、免疫原性低的溶血栓药物和治疗措施是当务之急。本发明所研发的单环刺螠纤溶酶通过介入溶栓方法证实具备完全溶解血栓的能力、无过敏等副作用。

发明内容：

本发明提供了介入溶血栓生物制品单环刺螠纤溶酶的制备工艺，包括以下步骤：

(1)取鲜活单环刺螠，收集其体腔液，将温度控制在-20℃-4℃之间、离心力控制在2000g-10000g之间进行冷冻离心30-35分钟，抽滤30-40分钟去除8KD(道尔顿)以上脂类不溶物，用PBS磷酸盐缓冲液透析8-10小时，真空冷冻干燥得到粗制品；

(2)将粗制品溶解在50mM、pH 7.8的碳酸氢铵缓冲液中，将温度控制在-20℃-4℃之间、离心力控制在2000g-10000g之间进行冷冻离心30-35分钟，注入经50mM、pH7.8碳酸氢铵缓冲液平衡的1.7cm×15cm的DEAE-Sepahcel阴离子交换柱、并用50-800mM NaCl进行梯度洗脱、经线紫外分光光度计(280nm)检测和收集的样品进行真空冷冻干燥后通过纤维蛋白平板法测定活性得到活性最高的样品A5、A6，合并为A56备用；

(3)将上述备用样品A56溶解在50mM、pH7.8的碳酸氢铵缓冲液，注入经50mM、pH7.8碳酸氢铵缓冲液平衡的Sephadex G-75凝胶过滤层析柱，利用注射用水洗脱，经线紫外分光光度计(280nm)检测和收集的样品进行真空冷冻干燥后通过纤维蛋白平板法测定活性得到活性最高的样品A56-3备用；

(4)将上述备用样品A56-3溶解在50mM Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷-盐酸)、400mM NaCl、pH7.4的缓冲液中，注入经50mM Tris-HCl、400mM NaCl、pH7.4缓冲液平衡的Benzamidine-SepharoseTM 4Fast Flow(苯甲脒琼脂糖凝胶)层析柱中，利用100mM glycine-HCl(甘氨酸-盐酸)、pH3.0缓冲液进行洗脱，3ml/管的洗脱液含有0.5mL0.5M Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷-盐酸)、pH9.0的缓冲液，经过纤维蛋白平板法测定的活性得到活性最高的部分就是单环刺螠纤溶酶A56-3-2。

附图说明：

图1为DEAE-Sephacel阴离子交换层析纯化单环刺螠纤溶酶粗制品A5、A6活性最高。

图2为Sephadex G-75凝胶过滤层析纯化单环刺螠纤溶酶流份A56-3活性最高。