[发明专利]一种从Cohn组分I沉淀分离纤维蛋白原的方法

说明书

技术领域

 本发明专利涉及人纤维蛋白原的分离方法，属于血液制品领域。

背景技术

1、纤维蛋白原

人纤维蛋白原(fibrinogen, Fg)即凝血因子I，是血浆中含量最高的凝血因子，也是凝血系统中的一个中心蛋白质；凝血的最后阶段是凝血酶形成，使纤维蛋白原转变为纤维蛋白；纤维蛋白原除直接参与凝血过程外，还可介导血小板聚集，影响血液粘度，是心、脑血管病发病的重要危险因素。

纤维蛋白原是一种含2964个氨基酸的大分子糖蛋白,相对分子质量为340×10³,首先在肝细胞中合成,由两个相同的组分(Aα,Bβ,γ)2组成六聚体,链间以二硫键相连。Aα,Bβ,γ三条多肽链借助AαCys28、γCys8和Cys9构成对称性二聚体。单体中AαCys36与另一单体BβCys65组成的二硫键对形成二聚体分子也起到关键作用。Aα,Bβ,γ三条多肽链相对分子质量分别为66×10³、52×10³和46×10³ ,并分别由610个、461个和411个氨基酸残基组成。

人纤维蛋白原主要由肝脏实质细胞合成，大部分在血浆中，约15%在血管外，正常人血浆含量为2.4-4.0g/L。平均半寿期为96-144小时。贮存稳定性好，热稳定差，在56℃可形成不可逆沉淀，生理止血需要量为正常水平的25%-50%。

在凝血共同途径中,凝血酶先裂解纤维蛋白原两条Aα链氨基端Arg16·Gly17释放出一对纤维蛋白肽A，形成纤维蛋白单体I；再裂解纤维蛋白原两条Bβ链氨基端Arg14·Gly15释放出一对纤维蛋白肽B,形成纤维蛋白单体Ⅱ，暴露纤维蛋白单体的聚合部位,通过非共价结合，形成了不稳定的可溶性纤维蛋白单体。在活化的凝血因子XⅢ及Ca²⁺的作用下,纤维蛋白单体互相交联,生成稳定的可溶性纤维蛋白,并将血液的有形成分包绕其中,形成牢固的血栓。

2、 纤维蛋白原制备技术概述

在血浆的采集、贮运和生产过程中，均可能产生凝血因子的激活，不利于获得稳定的人纤维蛋白原制品。通常，在关键的生产环节、半成品和成品中均要有针对性的检测这类反应。检出激活的方法包括有检验蛋白酶等。

目前成熟的人纤维蛋白原的分离原料包括有：新鲜冷冻血浆、冷沉淀、人凝血因子Ⅷ生产废弃液。常用的人纤维蛋白原的分离方法包括有硫酸钡沉淀法、乙醇沉淀法、离子交换层析法。由于与纤溶酶原（Plasminogen, PLG）有高度亲和性，故常用的分离方法难以获得高纯度的纤维蛋白原。

如下是几个具有代表性的乙醇沉淀法的技术要领。

大田华灿生物科技有限公司的发明《专利纤维蛋白原的制备方法》（ZL 201110188019.X）以血浆为原料，使用助剂后S/D病毒灭活，然后进行蛋白质分离。分离过程的温度控制较高，达到了36～38℃。该发明所采用的助剂,能提高纤维蛋白原制品的质量,在病毒灭活和冷乙醇沉降过程中起到保护纤维蛋白原以及凝血因子XⅢ的生物学活性的作用。

绿十字(中国)生物制品有限公司的发明专利《人纤维蛋白原的生产方法》（ZL 200910237204.6）提供了一种从冷沉淀中提取人纤维蛋白原的方法,生产中采用的S/D法和水浴热处理法双重病毒灭活。生产过程中使用甘氨酸作为稳定剂,通过延长冻干时间约需6-8天,使得产品在冻干过程中温度变化稳定,冻干后产品的结构均一,这时再对制品进行水浴热处理,可以在最短的时间内受热均匀,在达到有效的灭活DNA和RNA非脂包膜病毒的同时保证了人纤维蛋白原的稳定性。该方法的操作温度为20～40℃。通过延长冻干时间来换取了产品的稳定性。

江西博雅生物制药股份有限公司的发明专利《人纤维蛋白原制剂的制备方法》（ZL 200810046747.5）提供了一种从组分沉淀I制作纤维蛋白原的方法。该制备工艺中，使用了低浓度的蔗糖-柠檬酸三钠-氯化钠溶液，最后使用了精氨酸盐酸-柠檬酸三钠-氯化钠作为产品配制过程的保护剂。

哈尔滨世亨生物工程药业股份有限公司的发明《耐热人纤维蛋白原的生产方法》（CN 200710144516.3）提出了使用4％-6％蔗糖做稳定剂，蛋白质分离过程中的缓冲液一律使用醋酸缓冲液。

3 、现有技术的主要问题