[发明专利]抑制小鼠MACF1基因表达的shRNA序列及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种shRNA序列，特别涉及一种抑制小鼠MACF1基因表达的shRNA序列。还涉及这种抑制小鼠MACF1基因表达的shRNA序列的应用。

背景技术

微管微丝交联因子1(microtubule actin crosslinking factor 1，MACF1)，又名ACF7(Actin crosslinking factor 7)，是一种新的细胞骨架交联分子，定位于1p31-32上，含有5380个氨基酸，通过调节微丝、微管骨架动力学，在调节细胞迁移、细胞极化、细胞粘附、细胞信号转导、蛋白质运输等多种生物学功能中起重要作用。由于MACF1的广泛分布性及其在多种生物学功能中的重要作用，因此，研究其在不同组织中的功能具有重要意义。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。使用RNAi技术可以特异性沉默特定基因的表达，因此，该技术已被迅速而广泛用于特定基因功能、基因表达调控的研究及相关疾病的基因治疗研究领域。小发卡或短发卡RNA(small hairpin RNA或short hairpin RNA，shRNA)是一段具有紧密发卡环的RNA序列，通过载体可将shRNA导入细胞，导入的shRNA发卡结构被细胞机制切割成siRNA，由siRNA发挥作用达到沉默靶基因表达的作用。

文献1“Chen HJ,Lin CM,Lin CS,Perez-Olle R,Leung CL,Liem RK,The role of microtubule actin cross-linking factor 1(MACF1)in the Wnt signaling pathway,Genes Dev.20(2006)1933–1945.”报道了采用siRNA的技术方法降低了小鼠多能胚胎癌细胞系P19细胞和Rat-1稳定成纤维细胞系中MACF1的表达，并用了蛋白质免疫印迹检测了该siRNA在降低MACF1表达方面的效率，结果发现转染后这两种细胞系中MACF1的表达量降低了～65％。

文献2“Ka M,Junq EM,Mueller U,Kim WY,MACF1 regulates the migration of pyramidal neurons via microtubule dynamics and GSK-3 signaling,Developmental Biology.395(2014)4–18.”报道中使用shRNA的方法来降低MACF1的表达，同时采用电穿孔转染方法将针对MACF1的shRNA转到小鼠大脑皮质细胞中，蛋白质免疫印迹检测证明shRNA明显降低了MACF1的蛋白表达。

上述方法均在降低小鼠细胞中MACF1表达方面取得了显著的效果，但采用上述siRNA方法及电穿孔转染方法在降低小鼠前成骨细胞系中MACF1的表达时效率较低，且致死率较高，原因主要是小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1转染较为困难。

发明内容

为了克服现有shRNA序列抑制小鼠MACF1基因表达时效率低的不足，本发明提供一种抑制小鼠MACF1基因表达的shRNA序列及其应用。抑制小鼠MACF1基因表达的shRNA序列为：5'-GCTAGTGAATATCCGCAATGATTCAAGAGATCATTGCGGATATTCA CTAGC-3'，其中TTCAAGAGA为loop结构，其作用起始靶点是MACF1基因的第627位点。通过将抑制小鼠MACF1基因表达的shRNA序列克隆至pGLV3慢病毒载体上，得到含有所述shRNA序列的重组慢病毒载体；通过将所得到的重组载体用于转染小鼠细胞，达到抑制细胞中MACF1基因表达的目的。以上所述shRNA序列可明显抑制小鼠前成骨细胞中MACF1基因在mRNA及蛋白水平的表达，并且，通过抑制小鼠前成骨细胞中MACF1的表达抑制了前成骨细胞增殖、迁移和分化功能，提高了shRNA序列抑制小鼠MACF1基因表达时的效率。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种抑制小鼠MACF1基因表达的shRNA序列，其序列结构是5'-GCTAGTGAATATCCGCAATGATTCAAGAGATCATTGCGGATATTCACTAGC-3'，其中TTCAAGAGA为loop结构。

一种上述抑制小鼠MACF1基因表达的shRNA序列的应用，其特点是：