[发明专利]重组SIVgag与肠道病毒EV71型VP1融合基因的病毒样颗粒及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种重组SIV gag与肠道病毒EV71型VP1融合基因的病毒样颗粒，其特征在于，该病毒样颗粒是将融合基因gag-VP1克隆到真核表达载体及杆状病毒转座载体中分别得到真核表达载体和重组转座载体，然后真核表达载体转染哺乳动物细胞，重组转座载体转化DH10Bac感受态细胞制得重组杆粒，将重组杆粒转染TN5昆虫细胞，经分泌表达制得；

其中，所述融合基因gag-VP1是以重叠PCR法获得的SIV gag与EV71VP1的融合基因，且融合基因gag-VP1的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；

融合基因gag-VP1大小为2458bp、91kDa；

所述真核表达载体为pCAGGs，融合基因gag-VP1克隆到pCAGGs载体所形成的重组质粒为gag-VP1-pCAGGs；

所述的杆状病毒转座载体为pFastBac^TM1，融合基因gag-VP1克隆到pFastBac^TM1所形成的重组转座载体为gag-VP1-pFastBac^TM1。

2.一种重组SIV gag与肠道病毒EV71型VP1融合基因的病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)采用重叠PCR法制得融合基因gag-VP1，将融合基因gag-VP1克隆入杆状病毒转座载体pFastBac^TM1的EcoRI、NotI酶切位点之间，得到重组转座载体gag-VP1-pFastBac^TM1；

2)将重组转座载体gag-VP1-pFastBac^TM1转化DH10Bac感受态细胞，与Bacmid进行重组，经鉴定，得到重组杆粒gag-VP1-Bacmid；

3)将重组杆粒gag-VP1-Bacmid转染TN5昆虫细胞，直至细胞病变率超过80％后，离心收集上清，得到P1代病毒，将P1代病毒连续传代2次后，得到重组杆状病毒rBV gag-VP1；

4)将重组杆状病毒rBV gag-VP1以MOI为5接种TN5细胞，在28℃下悬浮培养72h后离心收集上清，经纯化制得重组SIV gag与肠道病毒EV71型VP1融合基因的病毒样颗粒；

所述的纯化具体操作为：

首先，离心后收集上清，将得到的上清经GE Quixstand系统超滤纯化，在4℃下进行浓缩；

然后，将浓缩产物经15％～50％的不连续蔗糖密度梯度，再在28000r/min、4℃的条件下超高速离心2h，收集不同浓度的蔗糖组分；

最后，用PBS洗涤，再经28000r/min超高速离心30min，沉淀经PBS重悬，得到纯化后的重组SIV gag与肠道病毒EV71型VP1融合基因的病毒样颗粒；

融合基因gag-VP1的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

3.权利要求1所述的重组SIV gag与肠道病毒EV71型VP1融合基因的病毒样颗粒在制备治疗手足口病的疫苗中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的疫苗为抗EV71病毒感染的疫苗。