[发明专利]单核细胞增生李斯特氏菌实时浊度LAMP检测方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种单核细胞增生李斯特氏菌的实时浊度LAMP快速检测方法。

背景技术

单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)是一类兼性细胞内生长的革兰阳性细菌，致病力较强，能引起人和动物的李斯特菌病，是重要的食源性人畜共患病原菌。单增李斯特氏菌营养要求不高，环境适应性强，既可在2～4℃下生长，也可在-18℃下存活，甚至在反复冻融的条件下仍可存活。近年来，欧美国家因食用李斯特菌污染的食品的病患呈上升趋势，世界卫生组织(WHO)已将其列为20世纪90年代以来食品中四大致病菌之一，成为许多国家食品卫生安全的必检项目。

目前，对单核细胞增生李斯特氏菌的检测仍以传统方法为主，不但检验周期长(4～7d)、操作繁琐，且准确性和灵敏性低，不利于食源性疾病的快速检测。因此，有必要提供一种更有效的检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种单核细胞增生李斯特氏菌的实时浊度LAMP快速检测方法，从而弥补现有技术的不足。

本发明首先提供一种用于检测单核细胞增生李斯特氏菌的LAMP引物组，引物信息如下：

LMO-F3：ATCGATCACTCTGGAGGA(SEQ ID NO:1)

LMO-B3：AAGCTAAACCAGTGCATTC(SEQ ID NO:2)

LMO-FIP(SEQ ID NO:3)：

TGAACAATTTCGTTACCTTCAGGATTACGTTGCTCAATTCAACATCT

LMO-BIP(SEQ ID NO:4)：

GGAGCGAAAACAATAAAAGTAAGCTGCGTAAACATTAATATTTCTTGCG。

本发明还提供一种利用上述的LAMP引物组检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法，包括有如下的步骤：

1)待检测基因组DNA的提取：用细菌基因组DNA提取试剂盒(上海生工)提取细菌DNA；

2)环介导等温扩增步骤：根据本发明设计的单核细胞增生李斯特氏菌的LAMP引物，加入反应体系中各组分，扩增温度为62.5℃，实时浊度仪中反应60min，80℃，5min，终止反应；

3)结果检测：直接通过实时浊度仪观察或扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

本发明针对单核细胞增生李斯特氏菌的溶血素基因设计一套LAMP引物，利用实时浊度仪对单核细胞增生李斯特氏菌进行检测，并验证检测方法的特异性和灵敏度，从而建立快速、特异、灵敏的单核细胞增生李斯特氏菌LAMP检测方法。

附图说明

图1：LAMP特异性试验结果图，其中曲线为单核细胞增生李斯特氏菌扩增曲线，其余11株其他菌株均未出现扩增曲线。

图2：LAMP灵敏度试验结果图，其中1～6为10-1～10-6浓度级稀释菌液，7为空白对照。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的方法进行详细的描述。

一、用于检测单核细胞增生李斯特氏菌的LAMP引物组的设计

本发明根据GeneBank中公布的单核细胞增生李斯特氏菌hlyA基因，进行序列的保守性分析，从中筛选出溶藻胶弧菌的高度保守序列，用Primer Explorer V4.0软件(http://primer-explorer.jp/e/v4-manual/index.heml)进行引物设计。设计合适的引物是进行LAMP反应的关键，通过考虑碱基组成，GC含量，二级结构的形成，Tm值等因素来设计溶藻胶弧菌LAMP反应的引物。引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。引物如表1所示：

表1 用于扩增单核细胞增生李斯特氏菌hlyA基因的LAMP引物序列

二、溶藻胶弧菌的LAMP引物的效果检测

1.1试验材料

菌株：单核细胞增生李斯特氏菌、拟态弧菌、溶藻弧菌、哈氏弧菌、河流弧菌、霍乱弧菌、拟态弧菌、志贺氏菌、沙门氏菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、创伤弧菌。

1.2细菌DNA提取

将供实验的菌株分别接种于5mL增菌培养基(单核细胞增生李斯特氏菌用TSB-YE培养液培养，弧菌用碱性蛋白胨水培养，其他菌株用BPW培养)中，按每种细菌的最适温度培养过夜，取1mL菌液，按照试剂盒说明书提取细菌基因组DNA。提取的基因组DNA于-20℃保存备用。